鼠肝星状细胞分离方法汇总精编版.docxVIP

……………………………………………………………医药资料推荐………………………………………………… PAGE PAGE 1 大鼠原代肝星状细胞的分离培养方法汇总：方法一雄性SD大鼠，体重400—500g。[操作步骤]1.大鼠以戊巴比妥钠麻醉，同时皮下注射5000U肝素钠抗凝；2.皮肤常规消毒后打开腹腔，钝性分离门静脉及下腔静脉；3.以16号套管针作门静脉插管，37℃灌注D-Hanks液，10ml/min至肝脏充盈，剪开下腔静脉放血后结扎。立即打开胸腔，以16号套管针作上腔静脉插管，形成门静脉-上腔静脉循环；4.以0.1％链霉蛋白酶E 5mL/min灌注3-4分钟，0.03％Ⅱ型胶原酶5ml/min灌注3-4分钟；5．取出肝脏，去肝包膜，用眼科剪剪碎。加入链霉蛋白酶E至终浓度为0.006％、DNA酶至终浓度为10pug/ml。37℃5％C02孵箱内消化30分钟；6.过200目筛网，培养液洗4次，将细胞铺于制备好梯度的细胞分离管中，对照管中加入等量培养液;7.4℃ 800g平抛离心30分钟。吸取1.040密度层的上层细胞，培养液洗2次；8.加入五血清RPMll640培养液，于37℃5％C02孵箱孵育15分钟：吸取细胞悬液，在6孔板中以含20％胎牛血清的RPMl1640培养。24小时后换液，此后每3天换液1次。方法二：[动物]雄性纯种Wistar大鼠，体重400-500g，普通饲料喂养。[操作步骤]1.大鼠用戊巴比妥钠麻醉，无菌操作下打开腹腔；2.经门静脉肝素化，取出肝脏，灌流液灌注10-20分钟(37℃)，至肝细胞略显黄色；3.链霉蛋白酶E溶液(0.02％)反复灌注10-20分钟(40—41℃)，胶原酶溶液反复灌注10-15分钟(40—4l℃)，至肝组织完全软化；4.两液合于器皿中，钝性撕碎肝组织，置三角烧瓶内37~C下振荡消化20分钟，三层纱布过滤；5.无钙培养液洗2次，将细胞悬液加至三层非连续密度梯度最上层(从下至上为1.080、1.058、1.053)，再在上面加一层无钙培养液，16000r／min离心30分钟(20℃)；6.轻轻吸取上层培养基与1.053层之间的细胞，细胞经无钙培养液洗2次后，调成(1-5)XlO5/ml浓度，接种于50ml培养瓶(内含20％小牛血清的RPMl1640培养液)；7.培养28h后换含新鲜10％小牛血清的RPMl1640培养液，以后每隔3—4天换液1次。 试剂：胶原4、DNase1、DMED、胎牛血清、Percoll、链酶蛋白酶 分离当日氯胺酮0.2ml/100ml体重、甘肃150U肌肉注射麻醉 严格消毒，置于无菌超净台，仰卧位固定 取大十字切口，上至剑突，下至耻骨联合，左右至两侧腋中线，皮瓣外翻，显露腹腔所有脏器。 将小肠翻至鼠体左侧，可见肝门出门静脉由脾静脉和肠系膜静脉汇合而成，在双侧肾静脉上方游离肝下腔静脉。 肝上游离肝膈面，下压肝脏剪短镰状韧带至肝上下腔静脉。 将9号输液针插入肝门静脉，动脉夹固定，转动灌流泵。同时迅速钳夹肝上下腔静脉，剪开事先游离好的肾静脉肝下腔静脉，开始原位灌注。 首先使用加葡萄糖1g/L、甘肃500U/L的D-Hank’s也200ml，经水浴加热到39℃，流苏20ml/min，尽量将肝脏内淤积的红细胞冲出， 使用酶灌注液0.05mol/L Ca2+、0.05%胶原4、D-Hank‘s液100ml，流速5ml/min，消化肝脏。 20min后使用无菌剪刀将肝组织剪下放入洁净的培养皿，进入细胞室。 在培养皿中去除肝包膜，将肝脏粉碎成糊状，放入0.05%胶原4、0.001%DNase1和5.3%FCS-HI的PBS中，37水浴摇动30min，使肝组织充分得到消化 将消化好的肝组织用200目筛网过滤，未通过的肝组织用玻璃注射器针芯研磨，与培养液冲洗。 滤过好的肝组织放入50mlFalcon离心管中，加入培养液只50ml，20℃100g离心5min，去除大部分肝实质细胞 上清液转入另一离心管中350g离心10min 去沉淀重悬于50ml培养液中，再次350g离心10min 沉淀重悬于16ml的PBS中，分两份分别加入已铺好梯度的Percoll顶层 Percoll的密度梯度分3层：由上至下依次为： 20% 1.012g/ml 20ml 35% 1.014g/ml 15ml 50% 1.018g/ml 10ml 铺好后4℃900g离心30min，轻轻取出，不要摇动液面，可见20%层中间有一混浊带 用16号针头插入液面下此处抽吸约10ml放入离心管 及培养液至50ml，900g离心10min，沉淀重悬于10ml混合培养液中，加胎牛血清 细胞计数，台酚蓝判断活力 液体配制： 预灌注液：葡萄糖1g/L、HEPES2.38g/L