基因重组与基因工程讲义.ppt

五、重组DNA的筛选和鉴定 由于重组体导入宿主细胞的比例通常较低，因此需要对含有重组体的宿主细胞进行筛选并作鉴定。可采用以下方法进行：? （一）根据重组体的表型进行筛选： 对于带有抗药基因的质粒重组体，可采用插入灭活法进行筛选。如pBR322中带有抗氨苄青霉素和抗四环素基因，当将目的基因插入抗四环素基因后，就可引起该基因失活，细菌对氨苄青霉素耐药，而对四环素敏感。在含氨苄青霉素的培养基上能够生长，而在含四环素的培养基上不能生长的细菌即为带重组体的细菌。 插入灭活法筛选重组体 （二）根据标志互补进行筛选： 当宿主细胞存在某种基因及其表达产物的缺陷时，可采用此方法筛选重组体。即在载体DNA分子中插入相应的缺陷基因，如宿主细胞重新获得缺陷基因的表达产物，则说明该细胞中带有重组体。 （三）根据DNA限制酶谱进行分析： 经过粗筛后的含重组体的细菌，还需进行限制酶谱分析进一步鉴定。将单一细菌进行扩增后分别提取其DNA，用重组时所用的同一限制酶进行酶切，再将其与不含目的基因的载体一起进行电泳比较分析，如发现出现目的基因片段的电泳带即证明重组体中带有目的基因。 （四）用核酸杂交法进行分析鉴定： 为了进一步鉴定重组基因体中的目的基因，可采用与目的基因部分互补的DNA片段作为探针，与含有重组体的细菌菌落进行杂交，经放射自显影，如结果为阳性，即可确定重组体中带目的基因。 获得带目的基因的细菌后，可将其不断进行增殖，从而得到大量的目的基因片段用于分析研究。如在目的基因的上游带有启动子顺序，则目的基因还可转录表达合成蛋白质。 五、转基因技术 1982年Palmiter等人首次将大白鼠的生长激素基因放在质粒中小白鼠金属巯基蛋白启动子之后。 这个启动子通常在染色体上，控制金属巯基蛋白的转录。 将重组好的这种质粒（几百个拷贝）用特制的微量注射器注入小鼠受精卵的雄性原细胞核（pronuc leus）中，再将这个受精卵植入小鼠子宫中。 结果发育生成的小鼠中经Southen杂交证明许多小鼠中都含有大白鼠的生长激素基因。而且成熟的小鼠体重比对照大两倍，成为“硕鼠”或“超级鼠”。这个实验首次证明，外源基因在新的启动子控制下可以整合到哺乳类细胞核内，并在其中实现有效地表达。转基因技术中有关外源基因与染色体的定位重组，表达调控等还有待深入研究。 六、体细胞克隆技术 1997年Nature杂志报导，英国学者I.Wilmut 等人，从一只胚胎羊中取出乳腺上皮细胞进行培养（供体），再用另一母羊的卵细胞（受体）摘出细胞核后，与上述乳腺上皮细胞进行体外融合。融合体经培养后，植入受体母羊的子宫中，结果融合体发育并分娩出一头小羊“多利”。称为克隆羊。这是20世纪生物科学震惊世界的成就。它表明成熟的体细胞可以不经过有性繁殖发育成个体。 基因重组与基因工程  Gene Recombination and Genetic Engineering 转基因植物获得新的性状 把大鼠生长因子转入小鼠 得到巨大型的转基因小鼠。 用噬菌体DNA构建 重组DNA分子 用质粒 构建 重组DNA分子 基因重组(gene recombination)是指DNA片段在细胞内、细胞间，甚至在不同物种之间进行交换，交换后的片段仍然具有复制和表达的功能。 基因工程(genetic engineering）是指采用人工方法将不同来源的DNA进行重组，并将重组后的DNA引入宿主细胞中进行增殖或表达的过程。 重组DNA技术 重组DNA技术又称为基因工程（genetic engineering）或分子克隆(molecular cloning)。 基因工程的操作过程主要由以下步骤组成： ①载体和目的基因的分离； ②载体和目的基因的切断； ③载体和目的基因的重组； ④重组DNA的转化和扩增； ⑤重组DNA的筛选和鉴定。 一、载体和目的基因的分离 为了进行基因重组，首先需要对载体DNA和目的基因分别进行分离纯化，得到其纯品。 （一）载体：基因工程中常用的载体(vector)主要包括质粒(plasmid)、噬菌体(phage)和病毒(virus)三大类。这些载体均需经人工构建，除去致病基因，并赋予一些新的功能，如有利于进行筛选的标志基因、单一的限制酶切点等。 1．质粒： 是存在于天然细菌体内的一种独立于细菌染色体之外的双链环状DNA，具有独立复制的能力，通常带有细菌的抗药基因。 最早使用的质粒DNA是人工构建的pBR322，该质粒分子大小为4.3kb，带有抗四环素和抗氨苄青霉素基因，含EcoRⅠ，BamHⅠ，HindⅢ等单一的限制酶切点。 质粒pUC19的分子结构 2．噬菌体： 可通过转染方式将其DNA送入细菌体内进行增殖。常用的为人工构建的λ噬菌体载体。噬菌