生物化学课件---维生素和辅酶.pptVIP

Section 4. 核 酸 的 性 质 一、核酸的粘性(Viscosity) 天然DNA溶液具有很高的粘性,但当DNA变性时其粘性急剧下降.根据大分字的粘度特征，高分子溶液比普通溶液的粘度大，不规则线团比球状分子的粘度大，而线性分子的粘度比无规线团的大。当DNA在溶液中处于天然状态时，由于双螺旋的刚性以及长长的线性结构，天然DNA的粘度很大，即使稀溶液其粘度也很大。DNA变性后，由于双螺旋的刚性失去，氢键断开，两条链彼此分开，单链分子处于随机卷曲状态，因而粘度急剧下降。因此，DNA粘度的改变，可作为DNA分子变性的重要指标。 ? 二、核酸的紫外吸收特征 核酸含有嘧啶碱和嘌呤碱基，因而DNA 和RNA在紫外光区具有吸收特性，其最大吸收在260nm处。 利用核酸和蛋白质紫外吸收差别，可鉴定核酸制品中蛋白质杂质。例如，纯净的DNA A260:A280的比值大约介于1.65～1.85. 若比值过高，则表明污染有RNA, 比值过低则表明有蛋白质或酚污染。 在核酸变性实验中，常引用摩尔磷消光系数。摩尔磷消光系数是指含磷为1.0摩尔浓度的核酸水溶液在260nm处的消光值,用ε(p) 表示： ε(p) = A260／C·L = A260×30.98／ W·L A: 被测核酸样品的消光值；C: 每升溶液中磷酸摩尔数； W: 每升溶液中磷的重量；30.98是磷的原子质量； L: 比色杯的内径。 核酸变性时，ε(p)值就会大大升高，当复性时，ε(p) 便降低或恢复到原来的水平，故ε(p) 可作为核酸变性与复性的重要指标。 ? 三、核酸的沉降特性和密度特征 1.? 沉降特性：核酸沉降的速度与它的分子大小及形状和结构有关。核酸的沉降系数(S) 与分子量之间呈现对应关系。由于分子的构象对它的沉降特性有很大的影响，故这种对应关系只是相对一定的构象而言，若分子量相同，其构象不同，则S就不同（图5-22）。同一种DNA，变性后的S要比天然的大。 2. DNA的(浮力)密度(buoyant density) 把DNA放在密度梯度介质的上面，以相当高的速度离心时，DNA在梯度中迁移，直到达到同它自己的密度相同的部位为止，即漂浮于介质的某一密度梯度中，该部位称作DNA的(浮力)密度。不同的DNA具有不同的(浮力)密度。可利用(浮力)密度的差别，借助密度梯度超离心法来分离制备DNA。 DNA的(浮力)密度与其分子的碱基组成有密切的关系，与G·C含量在一定范围内(20%--80%)呈正比关系。Schidkraut et al. 导出了下面公式： ρ = 1.660 + 0.098 ( G + C,) DNA的(浮力)密度与其分子构象有密切的关系，与分子大小无关。 DNA变性后，分子卷曲成致密的线团，故比天然DNA的(浮力)密度大。 四、DNA的变性与复性 1. DNA的变性 在水溶液中，双股DNA分子在某些物理因素或化学因素的影响下，双螺旋结构中的碱基堆积力和碱基对间的氢键受到破坏，严密的双股螺旋变成了两条单一的随机卷曲的多核苷酸链，该现象称作DNA变性。 热变性是DNA的一个极其重要的性质，在研究DNA时常用到这一性质。若将DNA稀溶液加热到80℃左右几分钟，双螺旋结构就会受到破坏，氢键断开，形成无规线团（图5-23）。这种变化叫做螺旋→线团转换（helix-coil transition）. ▲任何多聚核苷酸在260nm处都有一个特征性的紫外吸收的最大值，但这种吸收在天然DNA分子中，由于碱基的堆积而受到抑制，比组成双螺旋分子的两条单链处在随机卷曲状态的吸收或核苷酸单体的总吸收要低得多，这种现象称作低色效应或减色效应(hypo- chromic effect)。当DNA溶液慢慢加热到双螺旋开始解链前，在260nm处的吸收基本保持不变。但当温度达到一定高度(一般在750C以上)时，紫外吸收急剧增加直到两条单链完全分开成随机卷曲状态为止。紫外吸收随变性程度加剧而升高的现象称为高色效应或增色效应(hyper-chromoc effect)。一般来说，DNA分子变性后，紫外吸收增高30—40%.在热变性过程中，双股螺旋被解开一半的温度称为解链温度或融解温度(melting temperature) 或转换温度(transition temperature)，用Tm表示。 不同DNA分子的Tm差别与其碱基组成有密切关系。在标准条件下，即在0.15mol/L NaCl – 0.0l5mol/L的柠檬酸钠(1×ssc)溶液中，Tm与DNA碱基组成间的关系： Tm = 69.3 + 0.41(G + C)