核医学第8章-受体的放射性配基结合分析.ppt

一、受体标本的制备 在受体结合实验的研究中，所用的受体材料可以是组织切片，也可以是完整的单层培养细胞或游离活细胞，粗制的或纯化的细胞膜受体，可溶性的受体蛋白等。 （一）组织切片 冷冻组织切片常用明胶粘贴于玻片上，在温育缓冲液中与标记配基进行反应。反应后用缓冲液洗几次即可，切片厚度一般为5-50μm。用组织切片的目的更多是研究受体的分布（用放射自显影法或免疫组化）。 （二）游离的完整细胞悬液 完整的活细胞可以是血细胞，培养的单层细胞，肿瘤的腹水型细胞以及经处理的原代细胞等。 使用完整细胞的优点： 1、受体处于原有的正常环境中。膜未受扰乱，膜内pH、离子梯度也保存着。受体与其相连的效应系统（如G蛋白）也保存完好。 2、在受体功能反应完全的情况下研究受体，可以同时观察配基与受体结合的情况和细胞的生物效应。所得的结果更能反映受体的生理特点。 3、能直接给出平均每一个细胞的受体数。 注意点： 完整细胞的受体分析必须尽可能选用不易穿透细胞膜双层磷脂的标记物，否则由于游离配基进入细胞内可引起较大误差。 此外，还必须注意防止操作过程中可能导致细胞表面生理活性的改变。如，完整细胞的膜受体在37℃时会发生受体入内化现象，这会破坏结合反应的平衡状态，导致测定的KD值不正确，如80% EGF受体入内化，而在4℃则可阻止入内化。 （三）亚细胞组分 大多数受体的RBA需经差速离心法分成胞膜、胞浆、胞核，取所需组分进行分析。 其优点是： 除去大部分杂蛋白和内源性配基，减少NSB或其它干扰因素； 受体蛋白得到初步浓缩，使富集的受体制剂获得可靠的分析结果。 亚细胞组分的分离一般都采用差速离心法。一般先制成匀浆，再在含0.25～0.3mol/L蔗糖缓冲液中先后以不同离心力进行离心，分离不同的亚细胞组分。 实验过程应注意： 全部过程在4℃下进行操作，以保证受体标本的结合活性； 制备缓冲液的蔗糖密度，离子强度，pH值及其它物质（如 EDTA，Mg2＋）应严格控制。 为防止膜受体蛋白被蛋白酶水解常加蛋白酶抑制剂。 二、放射性配基的选择 制备优良的放射性配基是受体结合试验的首要条件。对任何一种受体系统，通常都有好几种标记配基可供选择。选择应从两方面考虑：①配基的特性；②实验目的。 （一）对放射性配基的基本要求 1、高比活度：组织细胞内的受体浓度一般都很低，约104-105个/细胞，或0.01-1.0 pmol/mg蛋白的水平，低比活度的配基难于达到分析灵敏度的要求。一般要求比活度在3.7×1011 Bq/mmol以上。 2、高亲和力: 可以减少标记配基用量 放射性配基与受体的结合物解离较慢，有利于结合和游离配基的分离。 2、核受体： 为一条氨基酸链，可分为四个功能区： A/B区:在不同受体中差异最大，主要功能是选择和激活基因转录。 C区:与染色体DNA结合的区域，上面有一定的氨基酸序列，能和靶基因上一定的核苷酸序列 (称作反应原件, response element) 相结合。 D区:主要作用是受体在核内的定位。 E区:与配基结合的区，并有转录激活作用。 受体的亚型 受体亚型：在分子结构上既有相似之处，又存在一定的差别，对一定的配基具有不同的亲和力，在生物学上具有不同的效应。 在药理实验等研究中发现，许多受体存在着两种或两种以上的亚型。只有内源性配基相同而氨基酸序列同源性很高的受体才可列为同一型的不同亚型。 例如表皮生长因子受体家族就包括表皮生长因子、HER2、HER3、HER4等四个成员。 受体数量：占细胞蛋白总量十万之一到百万分之一（一个细胞上仅有数千个受体分子），一般方法难以分离和测定受体分子。 配体：是指能和受体结合并引起相关效应的化合物。除了与受体结合外本身并无其他功能，它不能参加代谢产生有用产物，也不直接诱导任何细胞活性，更无酶的特点，它唯一的功能就是通知细胞在环境中存在一种特殊信号或刺激因素。 三、受体与配体的结合 配体与受体的结合是一种分子识别过程，它靠氢键、离子键与范德华力的作用，随着两种分子空间结构互补程度增加，相互作用基团之间距离就会缩短，作用力就会大大增加，因此分子空间结构的互补性是特异结合的主要因素。 同一配体可能有两种或两种以上的不同受体，例如乙酰胆碱有烟碱型和毒蕈型两种受体。同一配体与不同类型受体结合会产生不同的细胞反应，如Ach可以使骨骼肌兴奋，但对心肌则是抑制的。 配体可以是神经递质、激素、某些药物等。 四、受体与配基结合的特性 1、可饱和性(saturability) ： 每种受体在一个细胞上的量有一定限度，所以如果不断增加细胞周围配基的浓度，结合到细胞上的配基将渐趋饱和。 2、可逆性： 如果在放射配基与受体结合后将受体周围多余的放射配基移去(例