做组织RT-PCR标本的保存方法.docVIP

1.只要取组织是在组织离体30min内完成的、并且立即放入－80或液氮中保存的就对实验结果不会有影响。建议取材时将组织置于灭菌的冻存管中保存在液氮罐，取材前可以设计好每管中存放的组织量，以便后来RNA抽提时取用方便。有条件的话最好先在液氮中速冻，再放到－70℃中保存．快速冷冻能有效地防止ＲＮＡ的降解．若直接放置于－80度，样品的冷冻过程还是有点慢．２.冻存管也最好用ＤＥＰＣ处理．国产的很多塑料制品都比较脏，管内会有一些含ＲＮＡ酶的东西．一般我们采样用来包装样品的锡纸也要经过高温烘烤去除ＲＮＡ酶的．３．ＲＮＡlater一般用于不方便用液氮冻存的样品，或在不方便带液氮罐的情况下使用．但它对保存的组织大小有一定的要求，要切成比较小的块状，进口的ＲＮＡlater也比较贵．目前有QIAGEN公司的RNeasy Protect Kits提供一种RNAlater RNA Stabilization Reagent，只要在采样后立即加入这种试剂，即可保护样品中的RNA完整而不被降解。在RNAlater中的样品RNA可以在37度下稳定保存1天，或者在18—25度保存7天，2—8度稳定4周，或者在-20度永久保存。这种技术为在不同温度下采样，运输和保存样品提供了极大的方便，特别适用于各种动物组织、培养细胞、细菌、白细胞，但必须说明的是它不适用于全血或体液中RNA的保存。RNAlater的用法非常简单，只要在采样后立即将样品完全浸入适量（10ul/1mg组织）的RNAlater中即可。取样的动作要尽量快速利索，组织样品的大小以不超过0.5公分厚为宜，对于一些小的组织如小鼠的脾、肾等器官则可以整个取出浸入溶液中，较大的则应切开为厚度小于0.5公分的小块，以确保RNAlater能迅速扩散渗透入组织块中的所有细胞中。采样的容器应该足够大以容纳10倍于组织重量的溶液，避免组织块挤在一起，同时建议将溶液加满容器以避免在运输过程中组织块露出液面。注意本试剂只适用于新鲜样品，对于冷藏和包埋的样品请选用RNeasy Kit。保存后的样品可以直接用于RNA或者mRNA的抽提。RNAlater不会影响组织块的结构，可以在室温下切出适量的组织块用于称量和抽提RNA，剩下的部分可用于继续保存样品。-20度冻存的样品可以取出在室温下进行称量等操作而无需干冰。在-20度冻存的样品反复冻融20次RNA依然保持完好无损。RNAlater处理的样品比新鲜组织稍微硬一点，但对不会影响匀浆过程。实际上，抽提组织总RNA时，如果发生降解，最可能的环节是组织从液氮或－80冰箱内取出后解冻时间过长或使用匀桨器匀浆时操作时间过长，导致组织内细胞破裂释放RNA酶，而RNA酶灭活物质异硫氰酸胍又不能及时于之接触并使其灭活，因而将RNA降解。因此，现在我们在抽提总RNA时一般是取一定量组织放入碾钵内，边碾磨边加入液氮直至成粉末，然后加入到Sol D中，这样很少有降解的。当然，在抽提过程中DEPC处理tip及相关设备和带口罩、勤换手套防止RNA酶污染也是极为重要的。