粪大肠菌群检测方法.docVIP

粪大肠菌群的测定（多管发酵法） 检测限 试剂(均为分析纯) 1、配制单倍乳糖蛋白胨培养液（1份量）(因有固体培养基，以下配置方法仅做参考) 单倍乳糖蛋白胨培养液成分：蛋白胨10g、牛肉浸膏3g、乳糖5g、氯化钠5g、1.6%溴甲酚紫乙醇溶液1mL、碳酸钠10.6g。 1.6%溴甲酚紫乙醇溶液（1mL）：称取溴甲酚紫1.6g倒入小烧杯，用少量95%乙醇溶解，移至100mL容量瓶，用95%乙醇多次洗小烧杯，洗液移入容量瓶，最后用95%乙醇定容至100mL，摇匀备用。（滤纸、100mL小烧杯2只、100mL容量瓶1只、95%乙醇、玻璃棒、药匙、天平、滴管、溴甲酚紫） 碳酸钠（10.6g）：称取10.6g碳酸钠溶于蒸馏水，并定容到100mL。（100mL容量瓶1个、100mL小烧杯2只、碳酸钠） 将单倍乳糖蛋白胨培养液成分蛋白胨10g、牛肉浸膏3g、乳糖5g、氯化钠5g加热溶解于1000mL蒸馏水中，调节pH为7.2~7.4（用10%碳酸钠调节），再加入1.6%溴甲酚紫乙醇溶液1mL，充分混匀，分装于含有倒置的小玻璃管的试管(10mL左右)中，于高压蒸汽灭菌器中，在115℃灭菌20min，贮存于暗处备用（冰箱中可存放3个月）。(1L锥形瓶1只、1mL移液管1根、pH计、电炉、倒置的小玻璃管的试管60套（小试管(12x150mm ）+小套管（杜氏小管）（约 6mm × 36mm ) 2、三倍配制单倍乳糖蛋白胨培养液：制法同上，除蒸馏水外，其余配方比例三倍。 3、EC培养液（1份量） 将EC培养液所需成分胰胨20g、乳糖5g、胆盐三号1.5g、磷酸氢二钾（K2HPO4）4g、磷酸二氢钾（KH2PO4）1.5g、氯化钠5g，加热溶解于1L烧杯中，然后分装于含有玻璃倒管的试管中。用10%Na2CO3调节pH以防止培养基灭菌后pH上升0.2左右（确定值需要前期在实验室寻找规律）。再将分装试管置高压蒸汽灭菌器中，115℃灭菌20min。灭菌后pH应为6.9。（1L 在密封瓶中的脱水培养基成品要存放在大气湿度低、温度低于30℃ 三、耗材和仪器 1、仪器：高压蒸汽灭菌器、生化培养箱（恒温箱）（25-44℃ 2耗材：倒置的小玻璃管的试管70套（小试管(12x150mm）+小套管（杜氏小管）（约 6mm × 36mm )）；与小试管配套的棉塞或纱布和棉花；药匙、电炉、3mm接种环3根、吸耳球、牛皮纸、酒精灯1个、火柴、镊子2个、笔、试管架、滤纸（1盒）、、1mL及10mL移液管各2支 三、实验步骤 水样接种量 将水样充分混匀后，根据水样污染的程度确定水样接种量。每个样品至少用三个不同的水样量接种。同一接种水样量要有五管（平行）。 使用的水样量可参考下表。 水样种类 检测方法 接种量（ml） 100 50 10 1 0.1 10-2 10-3 10-4 10-5 井水 多管发酵法 × × × 河水、塘水 多管发酵法 × × × 湖水、塘水 多管发酵法 × × × 城市原污水 多管发酵法 × × × （如接种体积为10mL，则试管内应装有三倍浓度乳糖蛋白胨培养液5mL；如接种量为1ml或少于1mL，则可接种于普通浓度的乳糖蛋白胨培养液10mL中） 初发酵试验 将水样分别接种到盛有乳糖蛋白胨培养液的发酵管（含有玻璃倒管的试管）中（取原水样1mL，加如到9mL无菌生理盐水中混匀。这时候得到的稀释液1mL就相当与0.1mL，再按这个方法再稀释一次，就可以得到1mL相当于0.01ml的稀释液了。这时候取1mL加入发酵管中即可）。在37℃±0.5℃下培养24h±2h（箱内温度一定要达到所要求的温度(37.5±0.5℃)时，方可放入，下同）。产酸和产气的发酵管表明试验阳性。（培养液中加入溴甲酚紫作为酸度指示剂，细菌产酸后，培养液即由原来的紫色变成黄色。）产酸产气的发酵管表明试验阳性。如在倒管内产气不明显，可轻拍试管，有小气泡升起的为阳性。（需20支同规格试管） 记录：初发酵阳性管数 5个接种量为1mL管 5个接种量为0.1mL管 5个接种量为0.01mL管 阳性管数 复发酵试验 轻微振荡初发酵试验阳性结果的发酵管，用3mm接种环或灭菌棒(2-3环)将培养物转接到EC培养液中。在44.5℃±0.5℃下培养24h±2h（水浴箱的水面应高于试管中培养基液面，提高培养温度可造成不利于来自自然环境的大肠菌群的生长）。接种后所有发酵管必须在30min内放进水浴中 记录：复发酵阳性管数 由接种量为1mL管转接 由接种量为0.1mL管转接 由接种量为0.01mL管转接 阳性管数 Ps:接种过程（亦有参考视频可供学习） ① 接种前的准备工作。 a．检查接种工具，进行环境消毒。 b．在欲接种的培养基试管上贴好标签，标上接种的菌名、操作者、接种日期等。 c．将培养基、接种工具和其他用品