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His标签融合蛋白纯化步骤 （Ni-NTA琼脂糖凝胶亲和层析纯化法） 1. 缓冲液配制 Lysis Buffer 1 (under native condition) 0.5mM Tris.HCl 0.5M NaCl 5%(w/v) glycerol 10mM Imidazol 100mg(1mg/ml)lysozyme (Purification of 6xHis-tagged proteins from E.coli) 1% Nonidet P40 (NP40 = Igepal CA-630 ) 0.25% Tween 20 （or Triton 100 ） 0.02% NaN3 (Optional) 2 tablets of protease inhibitor cocktail (EDTA free ， Recommended) 200 µg(2µg/ml) RNase A (Optional) 1mg (10µg/ml) DNase1 (Optional) 50 mM NaF (Optional) 1mM Na VO (Optional) 3 4 + ddH O to 100ml, Adjust pH to 8.0 using NaOH 2 此 lysis buffer 适用于从 E.coli 、哺乳动物细胞和昆虫细胞中纯化带His 标签的蛋白质。仅在用 于裂解 E.coli 细菌时，加入溶菌酶。 Na3VO4 是磷酸酶抑制剂，保护磷酸化的蛋白不被磷酸酶还原。NaF 是酯酶抑制剂，保护脂蛋白 不被酯酶降解。 注意：当使用镍琼脂糖凝胶纯化带His 标签的蛋白时，缓冲液中不能加EDTA ，因EDTA 能使 镍从螯合物上脱离，从而使分离介质失去效果。 Lysis Buffer 2(under denature condition) 50 mM Tris-Cl 8 M Urea (or 6 M Gu-HCl) 10mM Imidazole 0.05% Tween 20 Adjust pH to 8.0 using NaOH Dialysis/Tev cleavage Buffer 50 mM Tris-Cl,pH8.0 100 mM NaCl (depends on solubility of protein) 2.5% glycerol 0.5mM EDTA 0.5mM DTT or TCEP 1 / 3 缓冲液A ： 50mM Tris.HCl 0.5M NaCl 5% glycerol 0.05% Tween 20 用高浓度HCl调节pH值至8.0。 缓冲液B （洗脱缓冲液）： 50mM Tris-Cl 0.5M NaCl 5% glycerol 0.05% Tween 20 500mM咪唑 用高浓度HCl调节pH值至8.0。 缓冲液C（咪唑梯度洗脱液）：用缓冲液A和缓冲液B按不同比例配制，配制比例如下（100ml 总体积）： 咪唑浓度 缓冲液A(ml) 缓冲液B(ml) 0mM 100 0