02 - 1 体积排阻色谱与光散射技术 SEC-MALS2014.pptVIP

 Size Exclusion Chromatography with Light Scattering Detection (SEC-MALS) Light Scattering University Wyatt Technology Corporation CHINA 主要内容 SEC技术与SEC-MALS技术 仪器参数确定 小 结 多角度光散射法：两种测定模式 单机模式 (Batch mode) Mw (weight-averaged molar mass)，Rz (z-averaged RMS radius) ， A2 无法测定：样品多分散性系数（ PDI ）； 联机模式 (Online mode, flow mode) Molar Mass，RMS ，Distributions，PDI； SEC = Size Exclusion Chromatography（体积排阻色谱） Size Exclusion Chromatography (SEC) ：基于高分子分子尺寸大小不同而分离的色谱法。（分子尺寸大小：hydrodynamic volume.） MALS = Multi-Angle Light Scattering（多角度光散射） SEC-MALS: 多角度光散射与体积排阻法联用技术 什么是 SEC-MALS ? 体积排阻色谱 传统SEC 假设弊端 Size exclusion chromatography of native and reduced, carboxymethylated Rnase Adapted from “Size-exclusion chromatography with on-line light-scattering, absorbance, and refractive index detectors for studying proteins and their interactions” by J. Wen, et al., Anal. Biochem. 240 155–166 (1996). 传统SEC 假设待测样与标样性质相似： 构象相似； 密度相似； 与柱填料无任何相互作用。 高分子表征的需要 多分散性样品: Mn, Mw, Mz, PDI (Mw/Mn) 单分散性样品: 检测，识别聚集体以及各组分的数量。 典型光散射与色谱联用配置 对于水相体系，建议使用0.1 µm 对流动相过滤；而对于有机相体系，建议使用0.2 µm 对流动相过滤； 使用在线脱气装置（In-line degasser）； 添加在线过滤器（ In-line membrane filter ）： 水相体系：PEEK 材质在线过滤器；有机相体系：不锈钢材质在线过滤器； 逐步增加或降低流速，切不可大幅度调整流速； SEC - MALS 测定法几点建议 * 以上建议有助于延长泵、柱子的寿命（即使不使用光散射仪）。 摩尔质量 - 定义 色谱洗脱曲线中，每一洗脱体积其摩尔质量由光散射仪测定。 色谱洗脱曲线中，每一洗脱体积其浓度由浓度型检测器测定。 范例: 2 个分子 (“1-mer” 和 “9-mer”) 相对分子质量分别是1和9ass 范例：摩尔质量计算 多分散性样品的摩尔质量 Mn Mv Mw Mz Mw 直接有LS测定 良好的SEC分离效果是精确测定摩尔质量的重要前提。 均方根半径 （旋转半径） Mean Square Radius: z-average mean square radius 直接由MALS测定 。 Astra 直接计算出数均、重均以及z-均方根半径。 Root Mean Square (rms) Radius rg: 单分子链中质量为mj链段 多分散性高分子：Z-average Mean Square Radius mj rj 模板参数创建（Template Generation ）: 归一化系数（Normalization coefficients）激光光电二极管检测能力差异修正 延迟体积（Alignment ）：检测器间管路体积。 宽峰校正（Band broadening）：样品稀释效应修正。 仪器系统有效性确认（System Validation） 模板参数创建与系统有效性确认 建立仪器参数: “第一针” -- BSA ASTRA 通过仪器配置自动识别、标记不同仪器、并存储数据。也可以支持第三方检测器如UV、RI等。 数据分析- Baselines 设定LS与浓度信号基线 设定基线时，其应覆盖可能的基线漂移区。 数据分析 – Peaks 单分散性高分子：选峰范围对结果影响很小。 多分散性高分子：选峰范围对结果影响较大。 使用各向同性的高分