叶绿体色素的提取、分离、理化性质和叶绿素含量的测定.doc

专业： 专业： 生物系统工程 姓名： 竺涵宇 学号： 3110100279 日期： 2013.03.27 地点： 生物实验中心 实验报告 课程名称： 植物生理学实验 指导老师： 成绩：_____________ 实验名称：叶绿体色素的提取、分离、理化性质和叶绿素含量的测定 实验类型：测定实验 同组学生姓名： 陈翔宇 一、实验目的和要求（必填） 二、实验内容和原理（必填） 三、主要仪器设备（必填） 四、操作方法和实验步骤（必填） 五、实验数据记录和处理 六、实验结果与分析（必填） 七、讨论、心得 一、实验目的和要求 掌握植物中叶绿体色素的分离和性质鉴定、定量分析的原理和方法。 二、实验内容和原理 以青菜为材料，提取和分离叶绿体色素并进行理化性质测定和叶绿素含量分析。原理如下： 1、叶绿素和类胡萝卜素均不溶于水而溶于有机溶剂，常用95%的乙醇或80%的丙酮提取。 2、皂化反应。叶绿素是二羧酸酯，与强碱反应，形成绿色的可溶性叶绿素盐，就可与有机溶剂中的类胡萝卜素分开。 C32 C32H30ON4Mg COOCH3 COOC20H39 C32H30ON4MgCOO—COO—+ 2KOH + C32H30ON4Mg COO— COO— 3、取代反应。 在酸性或加温条件下，叶绿素卟啉环中的Mg++可依次被H+和Cu++取代形成褐色的去镁叶绿素和绿色的铜代叶绿素。 H+取代Mg2+, Cu2+ (Zn2+)取代H+ 。 CCCC C C C C N C C C C N C C C C N C C C C N HH C CH HC C CH2 CH CH3 R1— H3C H3C— —CH3 C C C C N C C C C N C C C C N C C C C N Cu C CH HC C CH2 CH CH3 R1— H3C H3C— —CH3 4、叶绿素受光激发，可发出红色荧光，反射光下可见红色荧光。 透射光下呈绿色 反射光下呈褐色 5、定量分析。叶绿素吸收红光和兰紫光，红光区可用于定量分析，其中645和663用于定量叶绿素a,b及总量，而652可直接用于总量分析。 Relative absorbtance Relative absorbtance Waverlength(nm) Waverlength(nm) 三、主要仪器设备 1、天平（万分之一）、可扫描分光光度计、离心机 2、研具、各种容（量）器、洒精灯等 四、操作方法和实验步骤 1.定性分析： 鲜叶5g+95%30ml（逐步加入）,磨成匀浆 观察荧光现象 透射光 观察荧光现象 透射光 绿 色，反射光 红褐色 光。 皂化反应(3ml)加KOH数片剧烈摇均，加石油醚 皂化反应(3ml) 加KOH数片剧烈摇均，加石油醚5ml和H2O 1ml分层后观察 上层呈 黄绿 色，为 类胡萝卜素，吸收 蓝紫光 光。 下层呈 绿 色。为 绿色的可溶性叶绿素。吸收 红光和蓝紫 光。 过滤入三角瓶中 取代反应（1） 加醋酸约2ml，变褐（ 去镁 叶绿素）取1/2加醋酸铜粉加热变 墨绿 色， 为 铜代 叶绿素。 2、叶绿素和类胡萝卜素的吸收光谱测定： 皂化反应的上层黄色石油醚溶液 皂化反应的上层黄色石油醚溶液 反复用石油醚粹取,直到无类胡萝卜素,离心得叶绿素(盐) 在400-700nm处扫描光谱，分别测定类胡萝卜素和叶绿素的吸收峰 （稀释470nm OD 0.5-1） （稀释663nm OD 0.5-1） 3．叶绿素定量分析： 鲜叶0.1g，加1.9mlH2O，磨成匀浆，各取0.2ml加80%丙酮4.8ml,摇匀，4000转离心3min,上清液在645，652，663测定OD，计算Chla,Chlb 和Chl总量的值。 实验数据记录和处理 数据记录： 1、定性分析：荧光现象：透射光颜色为绿色，反射光颜色为红褐色。 1）皂化反应：上层呈黄绿色，为类胡萝卜素，吸收蓝紫光；下层呈绿色，为绿色的可溶性叶绿 素盐，吸收红光和蓝紫光。 2）取代反应：加醋酸变褐色，为去镁叶绿素，加醋酸铜粉加热变墨绿色，为铜代叶绿素 2、定量分析： 数据记录 645 652 663 样品1 0.113 0.16