细胞免疫的检测（小鼠淋巴细胞外周血单核细胞的分离）.docVIP

PAGE PAGE 1 细胞免疫检测（小鼠淋巴细胞/外周血单核细胞的分离） 1. 材料 脾细胞分离：75%酒精，瓶皿，镊子/剪刀（数套），RPMI-1640，灭活血清，8.3 g/l NH4Cl，匀浆器，15 ml离心管，EP管，枪头，细胞计数板，擦镜纸，台盼蓝 细胞因子的定量RT-PCR检测：RNA提取相关试剂及耗材，反转试剂盒，SYBGREEN，枪头，DEPC水。 细胞因子的ELISA检测：详细阅读说明书，严格按要求操作。 2. 脾细胞分离的具体步骤： （1）处死的小鼠置75%酒精中浸泡3~5 min，全身消毒灭菌。 （2）取出小鼠，放置于泡沫板右侧卧固定，剪开左侧背腹交界处皮肤，即可见到脾脏，分三套镊子/剪刀取脾脏： 第一套：剪开皮肤 第二套：剪开皮肤下的各种膜组织 第三套：剪开取脾 每5-8只小鼠换一次平皿、镊子/剪刀，以防循环操作过程中的污染 （3）无菌取出脾脏，置盛有不完全RPMI-1640的平皿中清洗后，转入无菌匀浆器中，加少许不完全1640，轻轻研磨。 （4）补加不完全RPMI-1640混匀，竖直静放2~3 min，使脾脏组织块下沉。 （5）轻轻吸取上清液入15 ml离心管中，1000 rpm离心10 min。 （6）弃上清，加入5 ml无菌的8.3g/l NH4Cl，静止5 min（去除红细胞），1000 rpm离心10 min。 （7）弃上清，用不完全RPMI-1640洗涤，1000 rpm离心10 min。 （8）弃上清，沉淀用完全2.5 ml RPMI-1640（含10% FBS）悬浮。 （9）细胞计数，台盼蓝染色，要求细胞活性应在95%以上。 （9）调整浓度为4×106 cells/ml。 整过程的原则——速度要快，以长时间的操作导致细胞活性下降以及大量死细胞的产生；防污染。 外周血单核细胞的分离： （1）无菌采集猪前腔静脉血5 ml，立即注入含有适量抗凝剂（肝素钠或枸橼酸钠）的无菌小瓶中，加盖后轻摇匀，使血液抗凝。 （2）再加入含3%血清的PBS（可降低红细胞的凝聚，提高分离效果），等体积稀释。 （3）吸取3 ml淋巴细胞分层液于无菌的15 ml离心管中，然后将离心管斜45度角，于距分层液界面上1.0 cm处沿管壁缓慢加入抗凝血（注意保持两者界面清晰，勿使血液混入分层液内 （4）2000 rpm 离心30 min，管内可分为四层（从上至下）： 第一层：血浆及大部分血小板 第二层：灰白色，为淋巴细胞层 和单核细胞层 第三层：分层液 第四层：红细胞及粒细胞 （5）无菌吸取单核细胞层加入另一离心管中，所得到的PBMC悬液用5倍体积的PBS重悬，1000 rpm离心10 min，以去除大部分混杂的血小板。 （6）用红细胞裂解液悬浮细胞沉淀，室温静置5 min（去除红细胞）, 1000 rpm离心5 min。 （7）用PBS洗再洗一次。 （8）沉淀用完全RPMI-1640（含10% FBS）悬浮。 （9）细胞计数，台盼蓝染色，要求细胞活性应在95%以上。 （9）调整浓度为4×106 cells/ml。 3．细胞因子的定量RT-PCR检测 （1）于24孔板中加入适量的相关刺激原（based on in vitro dose-response studies），然后将浓度为4×106 cells/ml的细胞悬液加至各孔内，每孔1 ml。 （2）置37 ℃，5 % CO2温箱中培养20 h，提取细胞总RNA并测定 （3）取0.5 μg RNA进行逆转录（TOYOBO反转录试剂）。 （4）定量PCR： Primer-Forward（IFN-γ/IL-4/β-actin） 1 μl（10 μM） Primer-Reverse（IFN-γ/IL-4/β-actin） 1 μl（10 μM） 2×SYBR Green Real-time PCR Master Mix 12.5 μl cDNA 1 μl ROX 0.05 μl H2O 9.45 μl 总25 μL 反应扩增条件为：95 °C预变性1 min；紧接着40个循环的94 °C变性15 s， 分析结果。 4．细胞因子的ELISA检测： （1）于24孔板中加入适量的相关刺激原（based on in vitro dose-response studies），然后将浓度为4×106 cells/ml的细胞悬液加至各孔内，每孔1 ml。 （2）置37 ℃，5 % CO2温箱中培养72 有些文献报道48 h即可检测对细胞因子进行ELISA检测，但经过比较发现，72 h检测时的效果更好。 （3）详细阅读说明书的实验步骤（不同牌子试剂盒稍有不同），严格按要求操作。 标准曲线是判定实验的质量。 5．淋巴细胞增殖实验（MTT法） MTT是一种噻唑盐，为