蛋白质和多肽的氨基酸序列分析报告.ppt

如一条15个氨基酸组成的多肽，其N末端为His，C末端为Glu。采用两套断裂方法： 第一套将肽段断裂成5个小片段，分别为Lys-Trp-Glu，Cys-Glu，Asp-Lys-Va-Asp，Leu-Pro-Ala和His-Lys-Ile-Tyr。 第二套肽段断裂为Glu-Asp-Lys，Ile-Tyr-Lys-Trp，Val-Asp-Leu-Pro，Ala-Cys-Glu和His-Lys。 通过N，C末端及重叠肽最后可定编为： His-Lys-Ile-Tyr-Lys-Trp-Glu-Asp-Lys-Val-Asp-Leu-Pro-Ala-Cys-Glu 二、二硫键位置的确定 取少量的样品，首先用碘代乙酰胺将肽链中未参与二硫键形成的巯基保护起来，然后用胃蛋白酶水解。 肽水解后，可用Brown和Hartlay提出的对角线法电泳分离。 将样品点在一张方形滤纸的中心点上，在pH 6.5的条件下行第一相电泳分离。然后将滤纸暴露在过甲酸蒸汽中，使二硫键氧化成半胱氨磺酸。若含有二硫键，即分成2个小肽。 可发现除了含有二硫键的肽外，其余的肽均仍在滤纸的对角线的位置上。而含半胱氨磺酸的肽比原来小，且带了更多的负电荷，因而偏离了对角线。 染色后，剪下偏离对角线的肽斑，分析其氨基酸顺序，与已确定的氨基酸顺序比较，即可确定二硫键的位置。 三、酰胺基位置的确定 多肽链中酰胺基以Asn或Gln形式存在。酰胺基在水解时，以NH4＋的形式释放，通过测定NH4＋量可以推测酰胺基的量。 通常，用蛋白水解酶水解可以得到含有酰胺基的肽段，将这些肽段分离后，测定其酰胺基数和推测可能形成酰胺基的数量（不包括C末端），如果二者数量相等，就可以确定酰胺基位置。若不符，应将肽链裂解为更小片段，再测酰胺基含量和可能存在的位置数目，直到两者相符为止。 Thank you! 知识回顾Knowledge Review 2．酶解法 酶解法相对化学裂解法而言，有许多优点，如专一性强、裂解条件温和、副反应少等，再则蛋白水解酶对肽链的水解率也比较高，而且不同的蛋白水解酶对不同氨基酸形成的肽键水解专一性不同。 因此，酶解法被广泛使用。 几种常用蛋白水解酶的作用位点 3．羟胺裂解法 羟胺（NH2OH）在碱性条件下（pH 9.0）能专一性裂解-Asn-Gly-间的肽键，也能部分裂解-Asn-Leu-或-Asn-Ala-间的肽键；在酸性条件可以断裂-Asp-Pro-间的肽键，产率可达80%。 4．部分酸水解 一般认为酸水解没有什么专一性而被忽视，后来发现部分酸水解还是有一定的专一性。 在稀酸的条件下，也即在高浓度胍的甲酸中（pH 2.5），可裂解-Asp-Pro-间的肽键，产率高达80%～90%。 在浓酸条件下，含羟基氨基酸氨基端肽键容易断裂。 但是终究部分酸水解的专一性差，副反应多，此法比较难掌握。 三、肽段的分离提纯 肽链经部分裂解得到肽片段必须分离提纯，才能进一步测定其氨基酸顺序。 先采用凝胶过滤，得到不同相对分子质量的肽片段组分，同时也脱去了样品中的盐类。然后，肽片段组分可用离子交换层析进一步提纯，也可应用双相高压纸电泳和层析相结合的方法，HPLC或FPLC具有更高的分辨率。 第四节肽段的氨基酸顺序测定 目前，进行蛋白质序列测定有二个关键步骤，即： ①氨基酸残基一个一个依次从蛋白质和多肽的末端切割下来。可采用化学法或酶法进行裂解。可以从蛋白质和多肽的N端进行裂解，也可以从C端进行分析。 ②正确鉴定每次切割下来的氨基酸残基。利用高效液相色谱，对带有生色基团的氨基酸残基进行分离分析。 二、 N端蛋白质序列仪 三、影响N端Edman反应裂解率的因素 第四节 肽段的氨基酸顺序测定 四、N端测序前样品处理 一、N端测序原理 五、C端测序原理 六、C端蛋白质序列仪 七、C端测序样品前处理 八、影响C端测序反应产率的因素 一、N端测序原理 至今应用最广的N端顺序测定法大多仍以Edman降解原理为基础。 偶联：蛋白质和多肽的自由α-氨基经与异硫氰酸苯酯(PITC)试剂偶联，与其紧挨的第二个残基的键合力大大减