转录组测序技术原及应用.pptVIP

SOAPdenovo首先将具有一定长度overlap的reads连成更长的片段，这些通过reads overlap关系得到的不含N的组装片段我们称之为Contig。然后，我们将reads比对回Contig，通过paired-end reads能确定来自同一转录本的不同Contig以及这些Contig之间的距离，SOAPdenovo将这些Contig连在一起，中间未知序列用N表示，这样就得到Scaffold。进一步利用paired-end reads对Scaffold做补洞处理，最后得到含N最少，两端不能再延长的序列，我们称之为transcriptome。如果同一物种做了多个样品测序，则不同样品组装得到的transcriptome可通过序列聚类软件做进一步序列拼接和去冗余处理，得到尽可能长的非冗余transcriptome。最后，将transcriptome序列与蛋白数据库nr、Swiss-Prot、KEGG和COG做blastx比对（evalue0.00001），取比对结果最好的蛋白确定transcriptome的序列方向。如果不同库之间的比对结果有矛盾，则按nr、Swiss-Prot、KEGG和COG的优先级确定transcriptome的序列方向，跟以上四个库皆比不上的transcriptome，我们用软件ESTScan（Iseli, Jongeneel et al . 1999）预测其编码区并确定序列的方向。对于能确定序列方向的transcriptome，我们给出其从5到3方向的序列，对于无法确定序列方向的transcriptome，我们给出组装软件得到的序列。 * 这篇文章重要是研究可变剪接的，体现了可变剪接的重要性，采用的实验材料。。。。如何混样。。测序策略。。。 * Identification of stress-associated alternative splicing. (A) Exons, introns and splice junctions were identified by the changes in expression levels (i.e., by the normalized number of the RNA-seq microreads encompassing each feature) under different abiotic stress conditions relative to untreated control. The “Exons” panel represents 807 differentially expressed exons; change in expression level ranged from - 30 to +82 fold normalized to untreated control. The “Introns” panel represents 1230 differentially expressed introns with expression changes ranging from -54 to +263 fold. The “Splice Junctions” panel features 1093 exon-exon splice junctions (with changes in normalized expression from -22 to +46 fold). Gene clusters were computed by the default settings of heatmap.2 in the R gplots package as described in the Methods. Up- and down-regulated features are shown in red and green, respectively; black corresponds to no change relative to the untreated control.也做了基本的基因注释，但是最重要的是做这5种胁迫条件下对外显子、内含子和可变剪接的比较，发现了不同的表现模式，一列指的是一个内含子，在高光条件下表达量红色上调，在加热条件下表达量绿色下调，这就出现了差异，从图上可以看出大面积的基因都受到5种胁迫条件影响。 表达量和结构都会受到胁迫条件的影响，看这个例子，低温胁迫下这个内含子和对照相比被保留了下来，揭示了可变剪接有重要功能 CCA1 是跟生物钟相关的基因，例如它调节气孔什么时候开关的，特别是4号内含子，本来应该是被剪切掉的，但是被保留下来了，再和参考基因组比对后，发现4号内含子有高度保守性，右