复合逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)对流感病毒的检测.ppt

复合逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）对流感病毒的检测 作者 ：蔡昌志 指导： 陆家海教授 欧阳丽萍老师 研究目的： 1.测试该实验是否对流感RNA病毒各型具有敏感性和特异性 2.为临床各种呼吸道感染的病原体 建立快速检验平台 3.为流感流行病学调查研究提供快速敏感特异性的检测技术 实验背景： 1.用聚合酶链反应（PCR）技术诊断肺部感染的病原是当前的热门课题。其快速简便、高度敏感和特异性等优点是细菌常规培养不能比拟的。 2.单采用一元PCR进行逐一筛选仍然费时费力。 3.虽然酶联免疫分析要花较少的时间,但酶联免疫分析缺乏敏感性 。 4.随着分子生物学的发展各种病原体的基因保守片段序列将逐一发现，各自特异性引物将合成出来。这将为复合逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）技术走向临床提供坚实的基础和良好的前景。 实验方法： 通过复合RT-PCR可一次有效的分离出各种呼吸道感染的病原体。对临床收集到的分泌物进行逆转录后的cDNA，并以各种cDNA为模板根据其核苷酸序列设计不同的特异性引物，并它们混合一起进行PCR扩增可得到不同大小的产物，然后可用琼脂糖凝胶电泳进行分离，就可诊断出肺部感染的病原体。 理想的五种引物的扩增产物根据它们的基因片段的大小可用复合PCR分离如下： bp M ViralRNA 600 500 H1（431） 400????????????????? B（390） RSVA（334） 300 H3（210） 200 　　RSVB（183） 150 ? 100 1.根据上图我们可知25#样品中只含有流感B型病毒，636#样品中含有流感H3型病毒并且还有一种未知的序列，但未知的序列对实验结果没有影响。现也可初步证实了复合逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）对流感病毒B型和H3亚型的具有特异性。 2.上面两张图的结果都不是很理想，给结果分析带来一定的难度，必须结合起来才能做出比较准确的判断。 实验讨论: 1.通过这段实验我们可以初步肯定复合逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）这种检测方法可以用于临床传染性疾病的诊断。它主要是设计不同病原体的特异性引物通过复合逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）扩增出不同大小的基因片段，再以琼脂糖凝胶电泳鉴别出不同的传染病病原体以确定临床诊断。 2.尽管复合逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）在分析紊乱基因片段时没有使用染色体DNA的方法具有高度复制性，特别是在分析RNA时还需要逆转录为cDNA这一复杂的过程。然而关键是复合逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）可同时具有快速、简便、高度敏感性和特异性的优点 。 ３.复合逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）全过程约在5小时内完成，可一次检测出呼吸道感染的多种病原体，使当天出检验报告成为现实，尤其是混合感染的病原诊断和如SARS（Severe Acute Respiration Syndrome）等急性流行呼吸道疾病时，我们可通过复合逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）快速做出诊断。 ４.随着分子生物学的发展各种病原体的基因保守片段序列将逐一发现，各自特异性引物将合成出来。这将为复合逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）技术走向临床提供坚实的基础和良好的前景。 实验尚存在的缺欠： １.目前实验由于时间和样品采样困难等原因，只能初步确定25#和636#两种样品中是否含有流感病毒，只能检测复合逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）对这两种流感病毒的特异性，并不能检测其敏感性。 ２.同时因为样品过少，实验不能实现同时检测更多病原体，很难验证该实验对呼吸道混合感染的多种病原体同时具有敏感性和特异性。 ３.实验的样品（流感病毒）是经过ＲＮＡ提取后的，与研究的样品来源有些差距，虽不影响结果，但不够理想。 ４.实验的结果不是很理想，使得此次研究的目的很难完全达到，应仔细探讨其中的原因，应试验改变实验条件，使其结果更理想。 参考文献： [1] Typing and subtyping of influenza viruses and respiratory syncytial viruses b