实验9植物染色体标本制备与核型分析.ppt

* * （综合性实验） 湖南文理学院生命科学学院 熊大胜 实验9 植物染色体标本制备与核型分析 1.掌握植物根、茎尖染色体制片技术，获得其染色体标本； 2.观察各分裂时期染色体形态,测量典型染色体长臂和短臂 第一部分 植物染色体标本制备 一、实验目的 3.了解植物染色体核型分析约定标准及关键技术。 力争通过该实验能让我们自主进行新资源植物染色体核型分析。如张伏安、谷南平等多位师兄用该技术分别完成了鱼腥草、白花败酱、五叶风藤核型分析；其论文发表在本院学报和中国野生植物资源上，也载入了他们的毕业论文。 二、实验原理 第一部分 植物染色体标本制备 1、预处理原理 8-羟基喹啉处理植物根茎尖分生组织中分裂细胞能达到3个效果。 ①障碍纺锤体形成 ③降低细胞质粘度 ②促进染色体缩短 二、实验原理 第一部分 植物染色体标本制备 2、去壁保真原理 纤维素酶和果胶酶降解细胞壁，既能使染色体分散到细胞膜外，且少受机械损伤，从而使染色体图象清晰逼真. 二、实验原理 第一部分 植物染色体标本制备 3、着色观察原理 姬母萨是伊红、天青色素和次甲蓝组成的复合染料。伊红是酸性染料，能与蛋白质带正电荷的氨基结合呈红色；次甲蓝是碱性染料，能与蛋白质带负电荷的羧基结合呈蓝色。包装染色体的蛋白质有大量的氨基和羧基，通过静电引力能与Giemsa有色基团结合着色。 因着丝粒和次缢痕蛋白质包装量比较少。请问他们的着色程度比染色体臂应该是深些还是浅些？ 主缢痕 二、实验原理 第一部分 植物染色体标本制备 4、核型分析原理 因着丝粒在染色体上的位置差异导致了各染色体形态差异。Denver将人体染色体划分成四大类型 请问：Denver划分如下4类染色体的臂比临界值标准是多少？ 三 实验器具及试剂 第一部分 植物染色体标本制备 1、显微镜 请注重显微镜使用登记和保养。 2、培养箱 注意显示温度校正和使用登记 显微数码互动室 (一)实验器具 三 实验器具及试剂 第一部分 植物染色体标本制备 1、氯化钾分子量为74.67，配制0.075mol/L浓度1000ml，称 KCI=？（5.6g，少许鲜蒸馏水溶解，定溶1000ml） (二)实验试剂 2、 0.002mol/L 8-羟基喹啉，分子量145.17 8-羟基喹啉0.29g，少许乙醇溶解，鲜蒸馏水定溶1000ml 3、45%醋酸：量取45ml冰醋酸定溶100ml 4、0.25%纤维素酶和果胶酶酶解混合液 纤维素酶、果胶酶各1g, 鲜蒸馏水分别溶解,定溶20ml, 再等量混合即可。 5、甲醇固定：甲醇：冰乙酸=3：1，鲜配鲜用 6、姬姆萨母液 姬姆萨3.8g与甘油250ml研磨15分钟，60℃水浴2小时，加60℃预热甲醇250m1，混匀、过滤，棕色瓶室温长期保存。 7、磷酸缓冲液：称Na2HPO4 4.735g，少许鲜蒸馏水溶解后，定溶500ml ；称KH2PO4 4.5.35g ，少许鲜蒸馏水溶解后，定溶500ml ，等量混合。 四 实验材料 第一部分 植物染色体标本制备 1、绿豆根尖 2n=22=8m+3sm 25℃浸种4-5h 发芽16-24h； 绿豆茎尖染色体 2、某植物茎尖 学生自拟前人还没有研究的新资源植物种，自采其茎尖 五 实验方法与步骤 1．正确取材 第一部分 植物染色体标本制备 ⑴根尖 能见根冠(根冠识别)。 2次3刀取材。预处理时切第1、2刀取近根冠1cm根段；酶解前第3刀取近根冠1-2mm根段。 2mm 8mm 1 2 3 色较深 五 实验方法与步骤 1．正确取材 第一部分 植物染色体标本制备 ⑵茎尖或叶芽 能见生长锥。2次2段取材。预处理采顶端2cm茎段，精心剥除多层叶片或幼叶，剥到能见生长锥(3类材料剥生长锥练习)。酶处理时取生长点1-2mm茎段。 2、预处理 五 实验方法与步骤 第一部分 植物染色体标本制备 ⑴药剂 0.002mol/L 8-羟基喹啉 ⑵方法 浸没全部材料； 25℃处理2小时。 3、前低渗 第一部分 植物染色体标本制备 ⑴方法 ①用0.075mol/L KCI冲洗3次 ②浸没全部材料 ③25℃下处理30-60min。 ⑵作用 ①促进质壁分离，利于去壁。 ②降低细胞质粘度。 五 实验方法与步骤 4、酶解去壁 第一部分 植物染色体标本制备 五 实验方法与步骤 ⑴方法 ①第二次取材,放入瓷板孔内； ②加2.5%混合酶浸没全部材料 ③26℃下处理4－5h； ④以一触即破为度。 ⑵注意事项 处理过程中防止酶液干燥。 5、后低渗 第一部分 植物染色体标本制备 五 实验方法与步骤 ⑴方法 ①酶液回收:用平口