粉纹夜蛾颗粒体病毒增强蛋白结构与功能的初步研究(精).ppt

粉纹夜蛾颗粒体病毒增强蛋白结构与功能的初步研究 王立娟 粉纹夜蛾颗粒体病毒增强蛋白结构与功能的初步研究 导师： 钟 江 教授 研究生： 王立娟，992305 研究方向： 分子病毒学 生命科学学院 微生物学专业 2002年6月10日 主要内容和时间安排 选题背景 实验材料和方法 实验结果与分析 总结与展望 预计时间：30分钟 杆状病毒概述 杆状病毒： 双链DNA病毒，有囊膜，感染昆虫 分类： 核型多角体病毒属（NPV) 颗粒体病毒属（GV) 形态与结构——两种表型： 包涵体来源型病毒（ODV） 出芽型病毒（BV）。 杆状病毒粒子的两种表型 杆状病毒双相生活史 第一时相： 时间：感染后的0-24小时 结果：产生大量的BV，出芽释放，在虫体内传播 第二时相： 时间：感染24小时以后 结果：形成大量的ODV，被多角体蛋白包裹，最终 形成多角体，经口感染其它宿主 杆状病毒多角体 电镜中看到的野生型AcMNPV的多角体 多角体的形成 干扰多角体形成的因素 多角体蛋白基因： AcMNPV多角体蛋白的3个Trp被Lys34, His36, 和Phe37替代——多角体能够结晶，但形态差异大，病毒粒子的包埋受影响 AcMNPV多角体蛋白第25位的Asp变为Gly——仅产生一个不正常的大立方形的多角体，不包埋病毒粒子 25K基因： 该基因突变后多角体数量减少 多角体的生物学功能作用 保护病毒粒子 感染昆虫所必需 选题背景—杆状病毒的应用 杆状病毒的应用： a. 杆状病毒表达载体系统 b. 杆状病毒生物杀虫剂 杆状病毒表达载体系统的优点 可以容纳大的插入片段（约10kbp）； 高效表达； 产物有毒性也可表达； 有外源DNA插入座位； 可以同时表达多个外源蛋白 可转译后加工修饰； 可在细胞系内表达，也可在昆虫活体内表达； 安全性好 选题背景—杆状病毒的应用 杆状病毒的应用： a. 杆状病毒表达载体系统 b. 杆状病毒生物杀虫剂 杆状病毒生物杀虫剂 优点： 安全有效， 不污染环境， 有后效。 缺点： 杀虫速度慢 杀虫谱狭窄 杆状病毒生物杀虫剂 构建重组杆状病毒杀虫剂的策略： a.表达昆虫激素 b.表达昆虫特异性毒素 c.删除内源性杆状病毒基因 d.应用增强蛋白来增强病毒的毒力 增强蛋白（Enhancin） En-Tn编码901个氨基酸，分子量为104ku 是一种金属蛋白酶： 都具有金属蛋白酶的金属离子结合基序： 增强蛋白（Enhancin） 在Genebank中运行Blast检索工具得到19条明显具有同源性的序列，去掉重复和非全长序列，共有13种不同的类似于增强蛋白的蛋白。 杆状病毒增强蛋白间的进化关系（Clustal法） 增强蛋白的增效机理 昆虫的围食膜 增强蛋白作用机理： 降解围食膜蛋白—粘蛋白IIM 提高围食膜的通透性 杆状病毒更容易进入昆虫体内 利用增强蛋白提高AcMNPV感染力 问题：表达增强蛋白的重组杆状病毒杀虫剂不形成多角体或多角体稀少 对增强蛋白的结构和功能了解不够 增强蛋白与多角体形成的相互作用 增强蛋白的在细胞中的分布及机理 项目来源和研究目的 项目来源：国家自然科学基金 研究目的： 进一步了解增强蛋白的结构和功能，更好的利用增强蛋白提高杆状病毒的杀虫效果。 主要内容 选题背景 实验材料和方法 实验结果与分析 总结与展望 实验材料和方法 实验材料： 草地夜蛾（Spodoptera frugiperda）卵巢组织细胞系SF21。 苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒（Autographa californica NPV，AcMNPV）1A分离株。 7种表达粉纹夜蛾颗粒体病毒（Trichoplusia ni Granulovirus，TnGV）增强蛋白基因不同片段的重组AcMNPV。 实验材料 重组病毒基因组所插入的增强蛋白基因片段 增强蛋白 2CTn PolyVEF #K #B #N/E 3dk 3ds 实验方法 细胞的培养与病毒的感染方法 杆状病毒的96孔板终点稀释法测定病毒效价 变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS） 免疫印记实验（Western Blotting） 病毒感染后细胞的免疫荧光组织化学分析 多角体的纯化和免疫荧光组织化学分析 细胞核、质的分离和制样 细胞和多角体的记数 实验方法 细胞的培养方法： Sf-21细胞用TNM-FH培养液加10%小牛血清在27℃下