离体实验模型在评价神经保护剂中的应用综述.docVIP

???? 离体实验模型在评价神经保护剂中的应用 ???? ????离体实验模型在评价神经保护剂中具有其独特的优点，它可解决在体动物实验所不能或极为困难解决的问题，还可评价药物在神经生化、电生理、基因表达等方面的作用，通过以上指标进一步探讨损伤的细胞机制；同时对研究神经细胞的生长分化、神经再生、突触建立、学习和记忆、神经调节、离子通道、神经免疫等具有广泛应用价值。 　　1　离体实验模型 　　神经科学研究中的离体实验模型包括单纯神经细胞、脑片培养模型、氧糖等营养物质剥夺模型，药物或毒物致损伤模型、物理因素致损伤模型及具有神经细胞样特性的细胞如PC12细胞株培养模型。　　1.1　离体分散神经细胞培养模型　包括神经元、神经胶质细胞和两者混合培养模型。实验动物多选用大白鼠，亦可选用小鼠、鸡、猴等。动物年龄多为胚胎后期组织，亦可为出生后数日内，按培养的目的和培养的部位不同而不同。如大脑皮层多取19天左右的大鼠胚胎或18天左右的小鼠胚胎较合适；小脑浦肯野细胞多取自大鼠胚胎；小脑颗粒细胞培养则应取自出生后的动物。培养基本过程包括取材、酶消化或机械分离、制备细胞悬液、接种。分散神经细胞培养的最大优点为可选择细胞培养的类型，如神经元、星形胶质细胞、少突胶质细胞等和选择一定的部位如皮层、小脑、海马区等。　　1.2　离体脑片培养模型　脑片培养最初是应用动态滚轴技术进行培养，手续烦琐，效果不理想。到90年代初，Stoppini等［1］发明了静态脑片培养技术，神经组织的器官特征保持良好，培养效果理想。脑片培养的动物一般以幼年为佳。培养过程包括取材、切片和培养，可用于形态学研究、电生理、基因表达等方面研究。　　1.3　氧糖剥夺(Oxygen and glucose deprivation,OGD)离体培养模型　在离体培养的基础上给以OGD模拟在体缺血，又称“离体缺血模型”。它包括化学性缺血模型、氧糖直接剥夺模型及造成氧糖剥夺的其它方法。　　化学性缺血模型即通过药物阻止能量的产生，如氰化物可通过与细胞色素氧化酶紧密结合抑制氧化磷酸化过程，阻止线粒体产生ATP。此模型的优点为无需特殊设备，制备迅速，可在正常空气环境下检测培养细胞。缺点为它不能很好地模拟在体急性脑缺血和再灌注。此外，影响代谢的药物对细胞还可能有其它作用，如氰化物不仅阻断线粒体复合体Ⅳ，而且还能阻止铜锌过氧化物歧化酶。　　OGD模型可通过直接通入不同浓度的氮气和二氧化碳等混合气体或其它隋性气体造成低氧或缺氧环境，同时培养基中剥夺糖来完成。此法可模拟在体脑缺血模型，但需要特殊设备。Goldberg等［2］利用套箱型缺氧工作室成功建立了离体缺血培养模型。国内多采用将培养的细胞放于密闭容器内，通入氮气和二氧化碳混合气体，一定时间内达到缺氧的目的；亦有研究者将培养板或培养瓶直接密封一定时间，待氧气耗尽，达到缺氧的目的。此外，营养物质剥夺模型还包括血清、神经营养因子、离子剥夺等。　　1.4　药物或毒物致损伤模型　包括上述化学性缺血模型，还包括兴奋性氨基酸［3］、自由基［4］等药物直接致损伤模型。　　1.5　物理因素致损伤模型　包括低温、热辐射等，其中低温对细胞的保护和损害的研究极为重要，为临床适度低温治疗神经系统疾病提供了理论依据。Onitsuka等［5］发现适度低温至33℃可保护海马区脑片CA1区神经细胞由于“缺血”所致的细胞损害。 　　2　离体实验模型的优点和缺点 　　离体实验模型的实验条件易于控制、恒定；实验周期短；可在“缺血”损害的过程中评价细胞的功能。离体实验模型的开放性使我们更易于应用光学仪器进行细胞功能的观察。离体药物评价可以避开在体动物实验中复杂的药代动力学、药物的转运途径、血脑屏障的通透率、组织的分布和靶细胞膜的渗透性，使药物直接作用于神经细胞，可以计算出药物的有效浓度和直接评价药物的作用。由于细胞外环境可以控制，很容易评价离子成分的作用。离体实验样本量大；神经细胞活性评价快速且直接。离体实验模型亦有不足之处，分离出的神经细胞与在体成年动物对应部位的神经细胞表现型不同，并且缺乏三维立体结构及相互连接。实验药物在细胞培养中能够减轻细胞损害，但是在动物实验模型中并不一定表现出神经保护作用。离体实验模型在筛选神经保护药物中起重要作用，但是疗效的最后验证尚需在体动物实验模型上完成。 　　3　离体实验检测神经细胞死亡的方法 　　目前认为细胞死亡存在坏死和凋亡两种形式。利用光、电镜、激光共聚焦显微镜、DNA断端原位末端标记(TUNEL)，线粒体荧光染科等技术观察细胞体、DNA、线粒体和细胞的形态变化；利用染料排除实验、LDH释放和线粒体膜电位的敏感荧光染料等方法可以从功能上了解细胞膜、酶和线粒体在凋亡和坏死中的变化；大分子合成抑制剂可挽救凋亡，但不能挽救坏死。利用细胞的形态、功能和