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“绿色荧光蛋白”让未知世界显影 Osamu?Shimomura Martin?Chalfie Roger?Y.?Tsien?（钱永健） 2008年10月8日，美Woods?Hole海洋生物学实验室的下村修、哥伦比亚大学的马丁-沙尔菲和加州大学圣地亚哥分校的钱永健三位美国科学家，因为在水母中发现和研究绿色荧光蛋白而获得2008年诺贝尔化学奖。 GFP发现之旅； 1962年，下村修首次从维多利亚多管水母Aequorea?victoria 中分离出GFP。他发现该蛋白在紫外线下会发出明亮的绿光。　　1992年，道格拉斯·普瑞舍克隆并测定了水母中绿色荧光蛋白的基因。 1993年， Martin?Chalfie证明了GFP作为多种生物学现象的发光遗传标记的价值。在最初的一项实验中，他用GFP使秀丽隐杆线虫的6个单独细胞有了颜色。　　1994年，钱永健开始改造荧光蛋白，培育出黄色、蓝色、绿色、红色等多种颜色的荧光蛋白，理解了GFP发出荧光的机制。世界上目前使用的荧光蛋白大多是钱永健实验室改造后的变种。令在同一时间跟踪多个不同的生物学过程成为现实。钱永健还开发了检测荧光蛋白的荧光探针技术。 GFP简介 维多利亚多管水母生活在北太平洋寒冷水域。这种水母体内含有一种生物发光蛋白质——aequorin，它本身发蓝光。GFP能把这种光转变成绿色，也就是当水母容光焕发的时候我们实际看到的颜色。GFP的纯溶液在典型的室光下呈黄色，但是当被拿到户外的阳光下时，它会发出鲜绿的颜色。这种蛋白质从阳光中吸收紫外光，然后以能量较低的绿光形式发射出来。 GFP结构 蛋白序列 SKGEELFTGVVPILVELDGDVNGHKFSVSGEGEGDATYGKLTLKFICTTGKLPVPWPTLVTTFYLQCFARYPDHMKRHDFFKSAMPEGYVQERTIFFKDDGNYKTRAEVKFEGDTLVNRIELKGIDFKEDGNILGHKLEYNYNSQNVYIMADKQKNGIKVNFKIRHNIEDGSVQLADHYQQNTPIGDGPVLLPDNHYLSYQSALSKDPNEKRDHMVLLEFVTAAGI GFP由238个氨基酸残基组成，分子量约为26.9kDa。 GFP结构 GFP晶体结构显示 , 蛋白质中央是一个圆柱形水桶样结构 , 长 420 nm , 宽 240 nm , 由 11个β片层组成桶状构成疏水中心和由4个α螺旋以及其中一个α螺旋包含着的发光基团构成。 1. 两个野生型 GFP吸收紫外光和蓝光，发射绿光，在 395 nm 出现一个最大吸收峰 , 在 470 nm 出现一个小的吸收。 出现两个吸收峰的原因可能是由于存在阴性和中性两个不同化学结构的生色团。由于存在两个吸收峰, 野生型 GFP 可以被标准的长波紫外 源和异硫氰酸荧光素 (fluorescein isothiocyanate , FITC) 所激发。 2. 能够在单独或者与其它蛋白融合时产生荧光。而其最显著的特点是除了氧气之外，不需要其他辅酶，不需底物。 3. Baird等研究人员发现，虽然GFP有紧密的桶状结构和形成发光基团所必需的复杂的翻译后修饰，当对GFP的N端和C端部分交换重排并以一段间隔重新连接时，GFP仍然具有荧光。并且，GFP的某些位点可以耐受整段蛋白的插入，在结合金属离子的黄色荧光蛋白（Yellow Fluorescent Protein, YFP，GFP的突变体）中145位插入锌指结构能使荧光强度多倍提高。 4. GFP作为报告分子具有很多优点，如实现了活细胞内基因表达和定位、荧光为蛋白的内在属性、荧光发射无种属依赖性、荧光信号对光漂白具有高抗性、检测时不需要附加辅助因子、在细菌和真核细胞中表达无明显毒性、具有高度稳定性。另外，细胞内GFP的检测也比较简单，如利用紫外灯、荧光显微镜、荧光激活细胞分选仪等，现有报道利用实时定量PCR进行GFP荧光定量测定的方法。 GFP应用 荧光互补不仅仅在蛋白质相互作用中有所应用，Jeong等研究人员以与底物结合时会有典型的构象变化麦芽糖结合蛋白（MBP）为模型，将MBP C端和N端分别与GFP片断融合。结果证明加入底物的一组显示出比对照组更强的荧光，由此提出split-GFP在观察蛋白构型变化中的应用。 另外，一种重要的荧光成像技术—荧光共振能量转移（fluorescence resonance energy transfer, FRET）也被广泛应用。它能够利用GFP及其突变体青色荧光蛋白（CFP）、黄色荧光蛋白（Y