谷氨酸生产工艺.docVIP

第一部分 实验目的 一．掌握谷氨酸发酵的操作原理：谷氨酸的生物合成途径、生物合成的调节机制、发酵条件对发酵过程影响的机制及其调控等。 二．掌握并实践利用生物发酵生产氨基酸的一般工艺流程、发酵生产过程中的基本操作。 三．熟悉各种实验仪器的基本原理并掌握其操作方法。 四．熟练掌握各项基本实验操作技能，并了解其应用原理。 第二部分 谷氨酸发酵的原理操作 一、谷氨酸的生物合成途径： 谷氨酸的生物合成主要包括糖酵解途径（EMP）、磷酸乙糖途径（HMP途径）、三羧酸循环（TCA环）、乙醛酸循环、伍德—沃克曼反应（CO2的固定反应等）。 由葡萄糖发酵谷氨酸的理想途径为： 氧化还原共轭的氨基化反应 氧化还原共轭的氨基化反应 CO2 CO2 谷氨酸 NADPH NADPH α-酮戊二酸 葡萄糖 异柠檬酸 EMP（为主） 2丙酮酸 柠檬酸 乙酰CoA 草酰乙酸 苹果酸 NH3 HMP（约占26%） NADP NADP HMP（约占26%） 在谷氨酸发酵时，糖酵解经过EMP及HMP两个途径进行，生物素充足菌HMP所占的比例是38%，控制生物素亚适量，发酵产酸期，EMP所占的比例更大，HMP所占的比例约为26%，生成丙酮酸后，一部分氧化脱羧生成乙酰CoA，一部分固定CO2生成草酰乙酸或苹果酸，草酰乙酸与乙酰CoA在柠檬酸合成酶催化作用下，缩合成柠檬酸，再经氧化还原共轭的氨基化反应生成谷氨酸。 由于三羧酸循环中的缺陷，即丧失α-酮戊二酸脱氢酶的氧化能力或氧化能力微弱，谷氨酸生产菌采用乙醛酸循环途径进行代谢，提供四碳二羧酸及菌体合成所需的中间产物等，因此，对异柠檬酸的两种竞争性反应是很重要的。在发酵的菌体生长期，为了获得能量和产生生物合成反应所需的中间产物，需要异柠檬酸裂解酶反应，走乙醛酸途径；在谷氨酸生产期，最好没有异柠檬酸裂解酶反应，封闭乙醛酸循环。这就说明，再谷氨酸发酵中，菌体生长期和谷氨酸生产积累期的最适条件是不一样的。 谷氨酸产生糖代谢的一个重要特征就是α-酮戊二酸氧化能力微弱。在铵离子存在下，α-酮戊二酸因谷氨酸脱氢酶的催化作用，经还原氨基化反应生成谷氨酸。 谷氨酸生产菌的谷氨酸脱氢酶活性都很强，这种每以NADP为专一性辅酶，谷氨酸发酵的氨同化过程，是通过连接NADP的L-谷氨酸脱氢酶催化完成的。在铵离子存在下谷氨酸脱氢酶与异柠檬酸脱氢酶紧密偶联起来，形成强的氧化还原共轭体系，使α-酮戊二酸还原氨基化生成谷氨酸。若铵离子进一步过剩，发酵液偏酸性，pH在5.5~6.5，谷氨酸进一步生成谷氨酰胺。 二．发酵过程主要变化及中间代谢控制 建立发酵过程的各种监控系统，对于发现和分析过程中出现的问题，及时对发酵的方向加以控制是高产和稳定的重要条件。为此我们必须了解： （1）.在短的间隔时间内过程所处的状态， （2）.微生物怎样适应环境条件的变化。即我们需要一种控制发酵的模型。 发酵过程主要变化规律及中间代谢控制的方法如下： A．适应期 发酵初期，菌体长大，但没有分裂，糖等基质基本不消耗，PH稍有上升是由于尿素分解放出氨气所致。 B．对数生长期 菌体开始繁殖，代谢逐渐旺盛。个体生长和群体繁殖交替进行，菌体形态和二级种子相同，绝大多数为E型分裂。耗糖速度逐渐加快，尿素被尿酶分解放出氨使PH上升，然后被菌体利又使PH下降，这时必须及时添加尿素来补充氮源和调整PH值，此阶段一般为3-10h C．转化期 在生物素限量的情况下部分菌体体内生物素含量由丰富转向贫乏，使部分菌停止繁殖，在条件适宜时开始伸长膨胀，形成生产型细胞，开始积累谷氨酸，这是菌体有增殖型向生产型转化的时期，在此时期中菌体数量达到最大值，V字型和伸长膨大型菌同时存在。 这是代谢最旺盛阶段耗糖加快，谷氨酸生成迅速增加，耗氧速率加快。并接近最大值. 对发酵控制来说，此时期以前的控制是发酵成败的关键，此时期的变化受生物素的明显影响，当生物素过量时，没有明显的转化期，菌体形态为粗状，短胖，类似粽子培养的菌型，耗糖快，耗脲快，产酸低，若生物素太少，菌的数量不足，耗糖慢产酸低，周期长 D．产酸期 菌体完成又正值期向生产期转化后，菌体都伸长膨大像花生，大量累积谷氨酸，耗糖与产酸相适应，产酸大最大值，对糖转化率达50-60%，应继续流加尿素，保证有充足的氮源，PH值维持7.0-7.2。为加快产酸速率适当提高温度，一般为36-37摄氏度。根据菌体的体积耗氧速率继续供氧，在正常的发酵情况下，这一时期中发酵已定局，容易控制。随着发酵时间的延长，糖已逐渐耗尽,产酸增加，菌体活力逐渐降低。流加尿素以少量为好，控制PH值6。8-7。0。当残糖降到1% 次倍增期间，开始出现异常形态的细胞；发酵后期，常出现类似花生状的有横膈膜的多节细胞，菌体形状基本清楚，谷氨酸高产。倘