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汞灯光源 激发滤色镜 分色镜 吸收滤色镜 荧光显微镜下的丝状细菌 反射荧光显微镜原理 汞 灯 激发滤色镜 分色镜 吸收滤色镜 物 镜 标 本 优点： 由于物镜兼作聚光镜，不需要很多调节。 物镜数值孔径不受限制，在高放大倍率时，也可以获得高分辨率的像。 厚的或不透明的标本也能观察，厚的盖玻片也能使用。 其它观察法也能与反射荧光结合使用，特别和相差法和透射微分干涉差法相结合。 可以避免不必要的荧光色衰褪现象。 缺点： 在用低倍率物镜时，像比较暗，因此必须用大数值孔径的物镜。 滤光镜系统必须有效地分离开激发光和荧光。 激发荧光的方式： 按光的波长范围分为UV激发法(使用紫外线照明法)和BV激发法(使用蓝紫光)两种。 UV激发法是用短于400nm的近紫外光进行激发。该法不存在可见的激发光，所以被观察的荧光呈现该染料固有的荧光，容易判别标本上的特异荧光和背景组织的自身荧光。 BV激发法是以404nm、434nm为中心的由紫外至蓝光进行激发。 该方法使用蓝光照射标本，所以荧光观察系统的截止滤光片必须使用可完全阻断蓝光并可充分通过所需绿、黄荧光的滤光片。 　　用于荧光抗体法的荧光色素，对于激发光的极大吸收波长和荧光的极大发光波长比较接近，所以BV激发法使用的滤光片必须使用锐截止式滤光片。该法可用蓝光作为激发光，所以荧光色素的吸收效率较高，可得到较明亮的图像。 其缺点是500nm以下的荧光无法看到，而500nm以上的使整个图像显黄色。在荧光抗体法中，大多以荧光色素特有的颜色来判断其特异性，所以在讨论微妙的特异性时，上述BV激发法的缺点往往影响极大。 荧光显微镜的照明可根据聚光器的构造和激发光的波长按以下三点考虑： ? ??? ①从荧光像的反差要求来看，UV激发暗场聚光器照明最好。 ? ??? ②以像的亮度来考虑，BV激发滤光片暗场观察效率最高。? ??? ③UV激发滤光片暗场观察和BV激发暗场聚光器照明的特性，可看作介于这两种照明方法之间，但前者滤光片暗场的性质较强，显示图像较明亮，反差小；后者因保留暗场光路的性质，故显示图像较暗，而反差有所改善。当实际使用荧光显微镜时，应采用最适合标本要求的照明法进行观察。 需要注意，即使像反差最佳的UV激发暗场聚光器照明，由标本折射或散射的部分紫外激发光也会进入物镜，这样在光学系统中的加拿大胶胶合面和光学玻璃因激发引起的自身荧光会使像的反应变坏。因此，必须在目镜前面使用紫外吸收滤光片作为截止滤光片（萤石或氟石玻璃）。 三、使 用 方 法 1．使用显微镜时请保持周围环境的清洁。 2．打开灯源，超高压汞灯要预热几分钟才能达到最亮点。使用荧光进行观察时，不要频繁的开关荧光电源。开关间断时间要保持在20～30分钟以上。 3．透射式荧光显微镜需在灯源与聚光器之间装上所要求的激发滤片，在物镜的后面装上相应的阻断滤片。落射式荧光显微镜需在光路的插槽中插入所要求的激发滤片／双色束分离器／阻断滤片的插块。 　　4．仪器的所有镜头均经校正，不得擅自拆开，如有灰尘沾在镜头上可先用吹风球将灰尘吹去，再用毛笔拂除。 　　５．载物台在不使用时不应放置过重的物体，以防止升降机构损坏。 ６．用低倍镜观察，根据不同型号荧光显微镜的调节装置，调整光源中心，使其位于整个照明光斑的中央。 ７．放置标本片，调焦后即可观察。 使用中应注意：未装滤光片不要用眼直接观察，以免引起眼的损伤；用油镜观察标本时，必须用无荧光的特殊油镜；高压汞灯关闭后不能立即重新打开，需经5分钟后才能再启动，否则会不稳定，影响汞灯寿命。 　　８．显微镜使用过后，应立即切断电源。并保持载物台的清洁。如使用100X油镜，请在使用后，用清洁液清洗。 　　清洁液配比，乙醚：酒精=7：3 观察荧光: 在示教台上的荧光显微镜下用蓝紫光滤光片，可见经0.01％的丫啶橙荧光染料染色的细胞，细胞核和细胞质被激发产生两种不同颜色的荧光(暗绿色和橙红色) 细胞器染色 激光共聚焦染色 四、注意事项 １．严格按照荧光显微镜出厂说明书要求进行操作，不要随意改变程序。 ２．应在暗室中进行检查，进人暗室后接通高压稳压器电源，开启3～5min后再开启激发高压汞灯，当看到高压汞灯完全亮后，停止激发，再开始观察标本。 ３．防止紫外线对眼睛的损害，做实验前将防护屏放下。 ４．检查时间每次以1h为宜，超过90min，高压汞灯发光强度逐渐下降，荧光减弱，标本