【精编】核酸化学课件.pptVIP

123 123 123 123 123 123 123 123 123 123 123 123 123 123 123 123 123 123 123 123 123 123 123 123 123 123 123 123 123 123 123 123 123 123 123 123 123 123 123 123 123 123 123 123 123 123 123 123 123 123 123 123 123 123 123 123 123 123 123 123 123 123 123 123 123 123 123 123 123 123 123 123 123 123 123 123 123 123 123 123 123 （五）核酸含量的测定 1.定磷法：钼蓝比色法 2.定糖法： 3.紫外吸收法 若260nm光吸收值为1相当于50μg/ml双螺旋DNA 或相当于40μg/ml单链DNA或RNA * 123 核酸的构象和分离 ρ：超螺旋DNA环状DNA线状DNA蛋白质 DNA 沉降 （六）沉降特性 超螺旋DNA * 123 （七）凝胶电泳 核酸研究中最常用的方法 优点：简单、快速、灵敏、成本低。 通过凝胶电泳 （1）可进行核酸分离，知道核酸的纯度。 （2）测定分子大小。 （3）估计核酸的构象。 * 123 凝胶电泳兼有分子筛效应和电荷效应 1．琼脂糖凝胶电泳（agarose gel electrophoresis） 琼脂糖凝胶电泳的迁移率主要与分子大小、胶浓度、核酸构象、电流等有关。 2．聚丙烯酰胺凝胶电泳 （polyacrylamide gel electrophoresis） 用于分析RNA或Mr小于1000bp的DNA片段 适用于大分子核酸，一般用于DNA分析。 * 123 DNA marker(DL-15000) ：15000，10000，7500，5000，2500，1000，250 DNA marker(DL-2000) ： 2000 ，1000，750，500，250，100 * 123 英国Sanger 1975年加减法，1977年末端终止法 美国Maxam和Gilbert 1977年化学断裂法 第七节 核酸中核苷酸序列测定 * 123 （1）酶法（双脱氧法、末端终止法） * 123 * 123 * 123 第八节 DNA聚合酶链式反应（PCR技术） 多聚酶链式反应(Polymerase Chain Reaction, PCR )：是一种对特定的DNA片段在体外进行快速扩增的方法。 * 123 原理 类似于DNA的变性和复性过程，即在高温（93-95℃）下，待扩增的靶DNA双链受热变性成为两条单链DNA模板； 而后在低温（37～65℃）情况下，两条人工合成的寡核苷酸引物与互补的单链DNA模板结合，形成部分双链； 在Taq酶的最适温度（72℃）下，以引物3’端为合成的起点，以单核苷酸为原料，沿模板以5’→3’方向延伸，合成DNA新链。 这样，每一双链的DNA模板，经过一次解链、退火、延伸三个步骤的热循环后就成了两条双链DNA分子。如此反复进行，每一次循环所产生的DNA均能成为下一次循环的模板，每一次循环都使两条人工合成的引物间的DNA特异区拷贝数扩增一倍，PCR产物得以2n的批数形式迅速扩增，经过25～30个循环后，理论上可使基因扩增109倍以上，实际上一般可达106～107倍。 * 123 PCR * 123 PCR结果： 0.8kb DNA Marker PCR product 3.0kb 实验结果(4?l) * 123 PCR 的特点及应用： PCR操作简便、省时、灵敏度高、对原始材料的质和量要求低。因此，广泛应用于许多领域。 基因克隆及定量、扩增特异性片段用于探针、体外获得突变体、提供大量DNA用于测序等； 遗传病的产前诊断； 致病病原体的检测； 癌基因的检测和诊断；　　 DNA指纹、个体识别、亲子关系鉴别及法医物证； 动、植物检疫； 在转基因动植物中检查植入基因的存在。 * 123 123 123 123 123 123 123 123 123 123 123 123 123 123 123 123 123 123 123 2．核糖核酸酶T1（ribonuclease T1，简称RNase T1） * 123 3．核糖核酸酶T2（ribonuclease T2，简称RNase T2） 主要作用点为Ap残基，水解速度AUGC A U C G A G * 123 （三）脱氧核糖核酸酶 1．牛胰脱氧核糖核酸酶 （pancreatic deoxyribon