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质粒大提试剂盒使用说明 货号：D1110 规格：10 次 保存：常温保存，复检期一年。 试剂盒内容： RNaseA ( 10mg/ ml ) 1ml 溶液 Ⅰ 60ml 溶液 Ⅱ 60ml 溶液Ⅲ 60ml 漂洗液 80ml 洗脱液 2 ×15ml 吸附柱 30ml 收集管(50ml) 10 个 说明书 1 份 产品说明： 本试剂盒采用碱裂解法裂解细胞，根据离心吸附柱在高盐状态下特异性 地结合溶液中的 DNA 的原理特异性提取质粒 DNA。 离心吸附柱中采用的硅 基质材料能高效、专一地吸附 DNA，可最大限度去除杂质蛋白及细胞中其他 有机 化合物 ，一般 从 50-100ml 大肠 杆 菌 LB 培养 液 中，可快速提 取 200-300 μg 高纯度高拷贝的质粒 DNA，提取率达 85-90%。 使用本试剂盒提 取的质粒 DNA 可适用于各种常规操作，包括酶切、PCR、测序、连接和转化 等试验。 使用前请先在漂洗液中加入无水乙醇，加入体积请参照瓶体上的标签。 溶液 Ⅰ在使用前先加入 RNaseA （将试剂盒中提供的 RNaseA 全部加入） ， 混匀，置于 2-8℃保存。如非指明，所有离心步骤均为使用台式离心机在室 温下离心。 操作步骤 : 1. 收集 50-100ml 过夜培养的菌液 11000rpm 离心 10 分钟，尽量吸 除上清 (菌液较多时可以通过多次离心将菌体沉淀收集到一个离心管中)。 2. 向留有菌体沉淀的离心管中加入 5ml 溶液 Ⅰ (请先检查是否已加 入 RNaseA) ， 使用移液器或涡旋振荡器彻底悬浮细菌细胞沉淀。注意：如 果菌块未彻底混匀，会影响裂解导致质粒提取量和纯度偏低。 3. 向离心管中加入 5ml 溶液 Ⅱ ，温和地上下翻转 6-8 次使菌体充分 裂解。 注意：①翻转一定要温和，以免污染细菌基因组 DNA。②作用时间不 要超过 5 分钟，以免质粒受到破坏。 4. 向离心管中加入 7ml 溶液Ⅲ ，立即温和地上下翻转 6-8 次，充分 混匀，此时会出现白色絮状沉淀 (如菌液过多，可在此步放置 5 分钟，以尽 可能的降解 RNA)。11000rpm 离心 10 分钟，用移液器小心地将上清转移到 另一个干净的离心管中，注意尽量不要吸出沉淀。 注意：溶液Ⅲ加入后应立即混匀，避免产生局部沉淀。 如果上清中还有 微小白色沉淀，可再次离心后取上清。 5. 将上一步所得上清液加入吸附柱中(吸附柱放入收集管中)，室温放置 2-3 分钟，11000rpm 离心 30-60 秒，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新 放回收集管中(如为提高得率，可将收集管中的液体加入吸附柱再次吸附一 次)。 6. 向吸附柱 中加入 8ml 漂洗液 (使用前请先检查是否 已加入无水乙 醇)，11000rpm 离心 2min，弃废液，将吸附柱放入收集管中。 7. 向吸附柱中加入 6ml 漂