苹果酸酶(malicenzymeme)试剂盒使用说明.pdf

苹果酸酶 （Malic enzyme, ME)试剂盒使用说明 产品简介： ME (EC0)广泛存在于微生物、培养细胞、动物和植物胞浆中，尤其在植物组织 中活性较高。ME催化苹果酸氧化脱羧的可逆反应，产生丙酮酸、CO2和NADPH，是苹果酸代 谢的关键酶。ME活性与生物合成和抗氧化密切相关。近年来植物ME活性测定较多，已经成 为抗氧化研究的热点。 ME催化NADP+还原成NADPH，在340nm下测定NADPH增加速率。 试验中所需的仪器和试剂： 紫外分光光度计、水浴锅、台式离心机、可调式移液器、1 mL石英比色皿和蒸馏水 产品内容： 提取液：60mL×1瓶，4℃保存。 试剂一：液体40 mL×1瓶，4℃保存； 试剂二：液体20mL×1瓶，4℃保存； 试剂三：粉剂×2支，4℃保存，用时每支加1mL双蒸水充分溶解备用； 试剂四：粉剂×2支，-20℃保存，用时每支加0.5mL双蒸水充分溶解备用； 操作步骤： 一、样品的前处理： (1) 细菌、细胞或组织样品的制备： 先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清，按照每200万细菌或细胞加入400 μL提取液，超声波破碎 （功率20%。超声3秒，间隔10秒。重复30次）。8000g4℃离心 10分钟，取上清，置冰上待测。 称取约0.1g组织，加入1mL提取液进行冰浴匀浆； 8000g 4℃离心10分钟，取上清， 置冰上待测。 (2) 血清(浆)样品：直接检测 二、测定操作表： 测定管 试剂一 （μ） 600 L 试剂二 （μ） 225 L 试剂三 （μL） 30 试剂四 （μ） 15 L 样本 （μ） 30 L 将上述试剂按顺序加入1 mL石英比色皿中，加样本的同时开始计时，在340nm波长下 记录20秒时的初始吸光度A1，迅速将比色皿连同反应液一起放入37℃（哺乳动物）或25℃ （其他物种）水浴中，准确反应2分钟；迅速取出比色皿并擦干，记录2分20秒时的吸光 度A2，计算ΔA A2-A1。 注意事项： 1， 若A2-A1大于0.5，需将酶液用提取液稀释，使若A2-A1小于0.5，可提高检 测灵敏度。 2， 实验时，试剂三、试剂四和样本在冰上放置，以免变性和失活。试剂一37℃ 或25℃水浴放置。 3， 比色皿中反应液的温度必须保持37℃或25℃，取小烧杯一只装入一定量的 37℃或25℃蒸馏水，将此烧杯放入37℃或25℃水浴锅中。在反应过程中把比色皿连同 反应液放在此烧杯中。 4， 最好两个人同时做此实验，一个人比色，一个人计时，以保证实验结果的准确 性。 ME活力单位的计算： 1、组织中ME活力的计算: (1)按样本蛋白浓度计算 单位定义：每mg组织蛋白在反应体系中每分钟生成1nmol的NADPH定义为一个酶活力 单位。 ME （U/mgprot）反应总体积 （900ul）÷样本体积 （30ul）÷反应时间（2min）÷NADPH -3 消光系数 （6.22×10