第五章目的基因与克隆载体的体外重组新.ppt

连接时考虑因素 实验步骤尽量简单易行 连接形成的节点序列应能被重新切割 对转录、转译中密码阅读不发生干扰 粘性末端连接 平末端连接 末端延伸连接： 末端转移酶（TDT）：在没有模板存在的条件下，能催化dNTP 随机加于DNA分子的3‘-OH端 人工接头：化学合成的两条互补寡核苷酸连，上面 带有一 至数个限制酶识别位点 作用：加至待克隆的平末端DNA片段两侧，酶切后 产生粘性末端 DNA衔接物：人工合成的双链寡核苷酸片段，一头为平末端 （与目的基因连接），另一头为特定酶的切后粘 性末端（与载体粘端连接） 基因工程的操作过程 切 接 转 增 检 连接方式 同聚物加尾 加人工接头 加DNA衔接物 粘性末端连接—单酶切产生的粘性末端的连接（同种酶） 5 5 GAATTC CTTAAG GAATTC CTTAAG EcoRI 5 G CTTAA AATTC G 5 退火 G CTTAA AATTC G 5 G CTTAA 5 AATTC G T4-DNA ligase GAATTC CTTAAG 5 5 GAATTC CTTAAG GAATTC CTTAAG 5 5 GAATTC CTTAAG 5 G CTTAA 5 5 AATTC G 5 5 GAATTC CTTAAG 5 EcoRI 粘性末端连接—单酶切产生的粘性末端的连接（同尾酶） BamHI 5 5 GGATCC CCTAGG GGATCC CCTAGG 5 G CCTAG GATCC G 5 5 T ACTAG 5 5 GATCA T 5 退火 G CCTAG GATCC G 5 T ACTAG 5 GATCA T T4-DNA ligase TGATCC ACTAGG 5 5 GGATCA CCTAGT 5 TGATCA ACTAGT 5 BclI TGATCC ACTAGG 5 5 GGATCA CCTAGT 粘性末端连接—双酶切产生的粘性末端的连接 5 5 GAATTC CTTAAG GGACTT CCTGAA EcoRI 5 G CCTGA AATTC G 5 退火 G CCTGA AATTC G 5 G CTTAA 5 GACTT A T4-DNA ligase GAATTC CTTAAG 5 5 GGACTT CCTGAA 5 G CTTAA 5 5 GACTT A 5 5 GAATTC CTTAAG EcoRI GGACTT CCTGAA BamⅢ BamⅢ 平末端连接 HpaI 5 5 GTTAAC CAATTG GTTAAC CAATTG 5 GTT CAA AAC TTG 5 5 CCC GGG 5 GGG CCC 3 T4-DNA ligase CCCAAC GGGTTG 5 5 GTTGGG CAACCC 5 CCCGGG GGGCCC 5 StuI 3 平末端连接--不同粘性末端的平端连接 BamHI 5 5 GGATCC CCTAGG GGATCC CCTAGG 5 G CCTAG GATCC G 5 5 CTGCA G 5 G ACGTC 3 T4-DNA ligase CGATCC GCTAGG 5 5 GGATCG CCTAGC 5 CTGCAG GACGTC 5 PstI 3 T4-DNA pol 切平 5 C G 5 G C Klenow 补平 5 GGATC CCTAG GATCC 5 CTAGG CGATCC GCTAGG 5 5 GGATCG CCTAGC 粘性末端的更换 BamHI 5 5 GGATCC CCTAGG T4-DNA ligase Klenow 补平 GATCC 5 G 5 G CCTAG 5 5 5 GGATC CCTAG 5 GATCC CTAGG 5 5 GGATCCTGCAGGATCC CCTAGGACGTCCTAGG 5 5 PstI CTGCAG GACGTC PstI linker 5‘ p 3‘ HO OH 3‘ p 5‘ TDT Mg2+ dATP AAAAAAAAAAAA OH 3‘ 5‘ p 3‘ HO p 5‘ 同聚物尾巴 Poly（dA） 末端延伸连接—同聚物加尾 C 3 G G 5 G 3 C 5 C 3 G T4-DNA ligase TdT TdT dTTP dATP GTTTTTTTTTT 3 C 退火 C 3 TTT