DC细胞制备标准操作程序.docVIP

崇州医院细胞治疗中心 标准操作程序 . DC细胞制备 SOP-TC-002 第 PAGE 2页 共7页 . DC细胞制备标准操作程序 目的和范围： 目的：规范DC细胞培养操作流程，保证细胞产品制备的稳定性、均一性。 范围：适用于实验室细胞培养技术人员DC细胞培养的全过程。 原理： 外周血PBMC经细胞因子诱导可分化为DC细胞。 相关文件： CIK细胞制备标准操作规程 记录 DC-CIK细胞制备记录。 物料： 试剂：75%酒精，碘伏，生理盐水，淋巴细胞分离液（Ficoll），GT-T551培养基，自体血清，DC因子-1，DC因子-2，肿瘤蛋白等。 仪器设备：生物安全柜，离心机，水浴锅，二氧化碳细胞培养箱，电动移液枪，10ul移液枪，医用剪刀，医用止血钳，试管架。 耗材：T25培养瓶（25cm2Flask），T75培养瓶（75cm2Flask）15ml离心管，50ml离心管，5ml移液管，10ml移液管， 200ul枪头。 职责： 细胞培养技术人员应严格按照本规程的规定进行DC细胞培养操作。 QA负责监督细胞培养技术人员的操作全过程，确保DC细胞培养操作的规范性。 审核人负责保证本规程的审核和全过程准确有效。 工作程序： 实验前准备： 洁净区需经过紫外线照射，连续照射时间不得低于30min.，实验过程中风机始终保持开启状态。 生物安全柜需经过开机紫外线照射，连续照射时间不得低于30min。并且开启生物安全柜玻璃防护窗，待生物安全柜内部气流稳定后，才可使用。 将实验所需器械放于物料传递窗进行紫外照射，（器械必须是经过高压灭菌锅消毒灭菌，并且在合格期以内）照射完毕后将器械盒用酒精进行擦拭消毒后，放入生物安全柜中备用。 单核细胞分离液（Ficoll），培养基，应提前准备好放入生物安全柜中，以便其回复常温，否则将会影响实验效果。 DC因子-1及DC因子-2在使用时置于冰块上方，即用即取，禁止在常温下长期放置。 分离培养 按照《CIK细胞制备标准操作程序》所述的方式分离提取PBMC。 接种： 用GT-T551培养基（加10%自体血清）调整细胞浓度为5~6?106/ml，铺入细胞培养瓶中，标记，水平放入37℃，5%CO2细胞培养箱内，若非透气孔培养瓶，应拧松瓶盖一圈。 -3小时后（拧紧瓶盖），取出，（注意轻拿轻放）经消毒后放入生物安全柜中。 沿培养瓶反面将细胞悬液全部倒入离心管中。 用5mlGT-T551培养基（加10%自体血清）刷洗培养瓶，涮洗液也倒入离心管中。 离心管中细胞悬液做CIK培养（详细步骤参照《CIK细胞制备标准操作程序》）。 沿原培养瓶反面加入10ml GT-T551培养基（加10%自体血清）。 加入DC因子-1，分装量10ul/支 ，每10ml培养基可添加1支（培养基不足10ml时按比例添加）。 标记，水平放入37℃，5%CO2细胞培养箱培养。 换液： 第一次直接加液5ml，换液方式如下： 准备耗材至生物安全柜：15ml离心管1个，GT-T551培养基（加10%自体血清），DC因子-1； 配制试剂：参考7.2.2.7步骤。 从培养箱中取出培养瓶，将离心管中培养基沿反面倒入培养瓶。 第二次开始半量换液，换液方式如下： 按7.3.1.1—7.3.1.2的方式配制预添加量培养基。 从培养箱中取出培养瓶，用移液管取半量培养基至15ml离心管中。 1200rpm，8min，去上清，加入已配制的培养基，重悬，混匀。 沿培养瓶反面倒入培养瓶中，转移至CO2细胞培养箱。 24h后添加DC因子-2：分装10ul/支，每20ml培养基可添加1支（培养基不足20ml时，可按体积比例进行添加）。 DC成熟后（一般约24h），将DC细胞悬液转移至CIK细胞悬液中共培养。 核对CIK细胞培养袋信息是否与DC细胞信息相符。 按CIK细胞制备标准操作规程（SOP-TC-001）7.5.1-7.5.3的步骤链接对应CIK细胞培养袋和注射器。 轻拍DC细胞培养瓶，使DC细胞完全悬浮，悬液倒入注射器中或移液管转移至CIK细胞培养瓶中。 用5-10ml培养基（含10%血清）涮洗培养瓶，并冲洗细胞培养面，涮洗液也倒入注射器中或CIK培养瓶中。 移去注射器，拧紧盖子，标记，放入CO2细胞培养箱。 填写相关记录，清场。 DC细胞收集回输：当DC细胞直接用于回输时按以下步骤。 复核DC细胞是否与回输计划信息相符。 取样本，经酒精擦拭后放入生物安全柜。 取50ml离心管，标记，打开离心管管盖。 轻拍DC细胞培养瓶，使DC细胞完全悬浮，悬液倒入离心管中。 用5-10ml生理盐水涮洗培养瓶，并冲洗细胞培养面，涮洗液也倒入离心管中，1200rpm，8min。 去上清，加入4