荧光定量pcr的实验技巧.docVIP

. . 荧光定量PCR问题疑难解答（一）两天我做标准曲线，线性关系还行，R平方0.998。但是扩增效率只有80%，另外扩增曲线也不是太光滑。2.我用SYBR作为荧光染料，样品的荧光强度也挺低的，只有100-200左右。 A：曲线不光滑有时跟染料的量相关，可以加大看看，或者就是扩增产物太少了。1. PCR反应效率差：引物，试剂PCR条件的原因。做realtime-pcr优化体系很重要，你的扩增效率低。可以增加Mg离子的浓度，如果其他条件都好了，还不行，那就是引物的原因，那你就只能重新设计引物了。2. PCR中混入影响反应的物质：模板提取方法需要改进3. 样品稀释不准确：这很重要，做标准曲线很多不好的时候，很多都是倍比稀释的问题，正常情况10倍比稀释时，前后是相差3.32个循环。Q：荧光定量PCR的灵敏度A：对于染料法的荧光定量来说，Ct值在13~30之间比较准确，30~33之间需要再次确认，在以上范围内的置信度比较差。Q：标准曲线要重复两三次吗?A：没有人说做定量PCR标准曲线要重复两三次，只是用来做标准曲线的梯度点最好不要少于4个，否则标准曲线准确性不高。Q：关于荧光定量标准曲线的制作A：一般的仪器虽然声称能进行单拷贝检测，但如果不是特别设计的体系，很难做到100拷贝以下的准确定量，一般用来做标准曲线的最小浓度为1000拷贝，再往下可靠性