溶菌酶的提取纯化及纯度测定.docxVIP

溶菌酶的提取纯化以及纯度鉴定 实验者：钟吴宇豪绿药1501班201530360127同组者：连学帆韩家鑫 实验地点：东配302实验日期：2017年5月26日-5月27日报告完成日期：2017年5月28日指导老师：易喻 【摘要】溶菌酶是一种具有水解细菌细胞壁能力的蛋白质，工业上通常以蛋清为原料，在pH6.5条件下用弱酸性阳离子交换树脂732吸附后，再用硫酸铵洗脱，经透析后冷冻干燥得到，在医学及食品商具有广泛应用。本文中我们通过等电点沉淀法对溶菌酶进行粗提取，然后通过离子交换层析进一步除去杂蛋白，提纯所得的溶菌酶粗品，并且通过紫外分光光度计检测溶液吸光度来对最后的产品进行纯度及产率鉴定，确认得到了纯化倍数较高但产率较低的溶菌酶产品。 Lysozymeisaproteinofbacterialcellwallhydrolysisability,theindustryusuallywitheggwhiteasrawmaterial,732exchangeresinadsorptionwithweaklyacidiccationundertheconditionofpH6.5,withammoniumsulfatewasdialyzedafterfreezedrying,iswidelyusedinmedicineandfoodbusiness.Inthispaperwebyisoelectricpointprecipitationmethodforcrudeextractionoflysozyme,followedbyionexchangechromatographytoremoveimpurityprotein,lysozymecrudepurified,andthemeasuredabsorbanceofthepurityandyieldofthefinalproductidentificationofUVspectrophotometry,confirmedthepurificationfactorwashighbutlowyieldthelysozymeproduct. 【关键词】溶菌酶，等电点沉淀法，离子交换层析，酶活，提纯 【引言】　对溶菌酶的研究始于20世纪初,人们发现人的唾液、眼泪中存在有溶解细菌细胞壁的酶,因其具有溶菌作用,故命名为溶菌酶。1937年Abraham和Robinson从卵蛋白中分离出溶菌酶晶体,揭开了研究溶菌酶的历史篇章。它广泛存在于鸟类、家禽的蛋清中和哺乳动物的泪液、唾液、血浆、乳汁、胎盘以及体液、组织细胞内,其中在蛋清中含量最丰富(约0.13%)在一些植物体如卷心菜、萝卜、无花果和微生物体内也存在溶菌酶,只是含量差异较大。 溶菌酶(1ysozyme)又称胞壁质酶、N-乙酰胞壁质聚糖水解酶。它能水解细菌细胞壁N-乙酰胞壁酸和N-乙酰氨基葡葡糖之间的β-1,4糖苷键,破坏肽聚糖支架,低滲溶液中细胞在内部滲透压的作用下胀裂开,引起细菌裂解。溶菌酶主要溶解革兰氏阳性菌的细胞壁。 溶菌酶是一种无毒、无副作用的蛋白质,又具有溶菌作用,因此可用作食品防腐剂。目前已广泛应用于水产品、肉食品、蛋糕、清酒、料酒及饮料中的防腐,溶菌酶属于冷杀菌,在杀菌防腐过程中不需加热,因而避免了高温杀菌对食品风味的破坏作用,尤其对热敏感的物质更具有重要意义。还可以添加到乳粉中,使牛乳人乳化,以抑制肠道中腐败微生物的生存,同时直接或间接地促进肠道中双歧杆菌的增殖。此外,还能利用溶菌酶生产酵母浸膏和核酸类调味品。在生物工程研究上，随着生物科学的发展,溶菌酶已成为基因工程及酶工程中必不可少的工具酶。在医疗中，溶菌酶对G+、枯草杆菌等有很好的杀灭作用,对大肠杆菌、普通变球菌等G-也具有一定程度溶解。此外,溶菌酶与抗菌素合用效果更佳,因而,溶菌酶广泛应用于医药行业,如利用溶菌酶治疗各种五官科炎症,尤其对急性炎症如急性咽炎、急性喉炎、急性中耳炎等效果明显。溶菌酶在畜禽饲料中，由于溶菌酶本身是一种天然蛋白质,无毒性,是一种安全性高的饲料酶,它能专一性的作用于目的微生物的细胞壁,而不能作用于其它物质。该酶对革兰氏阳性菌、枯草杆菌、耐辐射微球菌有很强分解作用。 为了从鸡蛋清中提取并提纯得到的溶菌酶，我们分别采用了等电点沉淀法得到了溶菌酶粗品，然后通过离子交换层析提纯得到的样品，最后测定了所制的溶菌酶活性及蛋白质含量。 【实验部分】 1.1试剂与仪器 1.1.1试剂 250mL烧杯、玻璃棒、小漏斗、定性快速滤纸、50mL量筒、50mL离心管、鸡蛋1只、0.02mo1/LPBS(pH7.0、pH8.0、),lmLEp管,pH计,移液管1m1、冰醋酸、5mo1/LNaOH,滴管,离心管，样品S1、S2、S-2,CM一纤维素高子交换介质.,0.02mo1/Lp