第十三章_核酸扩增仪.pptVIP

金属板式实时荧光定量PCR仪 即传统的96孔板式定量PCR仪，由第三代的半导体PCR仪发展而来，在原位PCR仪的基础上，增加荧光激发和检测模块，升级为荧光定量PCR仪。 可作普通PCR仪使用，带梯度功能，但温度均一性差，有边缘效应，标准曲线的反应条件难以做到与样品完全一致。 金属板式实时荧光定量PCR仪 激发光源多为卤钨灯，与5色滤光镜配合，可同时激发96或384个样品；检测器为超低温CCD成像系统，可同时多点多色检测，能有效分辨FAM／SYBRGreenI、VIC／JOE、NED／TAMRA／Cy3等多种荧光染料。 随机配制的定量PCR引物和探针设计软件Primer Express可以设计定量PCR所需的Taq Man探针。 有实时动态(Real-Time)和终点读板(Plate Read)两种模式。 实时荧光定量PCR核酸扩增仪 金属板式实时荧光定量PCR仪 离心式实时定量PCR仪 各孔独立控温的荧光定量PCR仪 离心式实时定量PCR仪 离心式实时定量PCR仪器的样品槽被设计为离心转子的模样，借助空气加热，转子在腔内旋转，每个样品孔之间的温度差异小于0.01℃，保障了标准曲线和样品之间反应条件的一致性。 激发光源大多采用发光二极管(LED)冷光源，运行前无需预热，无需校正。系统误差少，定量线性范围可达l0个数量级。 缺点：离心转子小，可容纳样品量少，有的需用特殊毛细管作样品管，增加了使用成本，也不带梯度功能。 离心式实时定量PCR仪 Rotor-Gene 3000荧光定量PCR仪 Light CycleTM荧光定量PCR仪 离心式实时定量PCR仪 Light CycleTM荧光定量PCR仪结构示意图 实时荧光定量PCR核酸扩增仪 金属板式实时荧光定量PCR仪 离心式实时定量PCR仪 各孔独立控温的荧光定量PCR仪 各孔独立控温的荧光定量PCR仪 各孔独立控温的定量PCR仪设计非常独到，不同样品槽分别拥有独立的智能升降温模块，各孔独立控温，可以在同一台定量PCR仪上分进行不同条件的定量PCR反应，随时利用空置的样品槽开始其他定量反应，使用效率非常高。 升降温速度高达10℃／s，控温精度高。每个模块独立控制的激发光源和检测器直接与反应管壁接触，保证荧光激发和检测不受外界干扰。 各孔独立控温的荧光定量PCR仪 该类仪器整合多通道光学检测系统，能有效分辨多种荧光染料，可对同一样品进行多靶点分析，同时检测四种荧光信号。 可使用Taq man探针、分子信标、Amplifluor引物等多种检测方法，定量线性范围可达9个数量级。其软件允许一台仪器同时操作多个样品模块，既满足高速批量要求，又能灵活运用，还可实现任意梯度反应。 缺点：上样不如传统方法方便，而且需要独特的扁平反应管，使用成本较高。适合多指标快速检测，但目前在国内应用尚少。 第二节 PCR扩增仪的分类与结构 SmartCyclerⅡ荧光定量PCR仪 第三节 PCR核酸扩增仪的性能指标、操作规程 及常见故障的排除 PCR核酸扩增仪的性能指标 PCR核酸扩增仪的操作规程 PCR核酸扩增仪常见故障的排除 PCR核酸扩增仪的性能指标 性能 指标 温度 控制 荧光 检测 其他 温度的 准确性 热盖 温度 不同模 式下的 相同温 度特性 升降温 的速度 温度的 均一性 CT值 重复性 误差 检测 通道 数量 荧光 检测 范围 基座 容量和 样品数 软件 功能 温度控制 温度的准确性 是指样品孔温度与设定温度的一致性，是PCR反应最重要的影响因素之一，直接关系到实验的成败。 温度的均一性 是指样品孔间的温度差异，关系到不同样品孔之间反应结果的一致性。 如：“位置的边缘效应”会影响结果的可重复性。 升降温的速度 升降温速度快，能缩短反应进行的时间，提高工作效率，提高PCR反应特异性。 温度控制 升降温的速度 升降温速度快，能缩短反应进行的时间，提高工作效率，提高PCR反应特异性。 热盖温度 热盖可使样品管顶部温度达到105℃左右，避免蒸发而改变PCR反应体积，无需再向反应管内添加石蜡油，减少了后续实验的麻烦。 荧光检测 CT值重复性误差 荧光检测范围 检测通道数量 其 他 常用样品管：0.2、0.5ml PCR管；8、12联排管；96孔微孔板等 其 他 新型的PCR仪都常规使用优质配套软件，此类软件易学易用，还具有实时信息显示、记忆存储多个程序，及自动倒计时、自动断电保护等功能，很多仪器还可以免费升级。 第三节 PCR扩增仪的性能指标 操作规程 常见故障的排除 PCR核酸扩增仪的操作规程 普通PCR扩增仪的操