实验三-血清蛋白醋酸纤维素薄膜电泳教学提纲.pptVIP

血清蛋白质醋酸纤维素 薄膜电泳;一、目的; 血清中含有白蛋白、α-球蛋白、β-球蛋白、γ-球蛋白等，各种蛋白质由于氨基酸组分、立体构象、相对分子质量、等电点及形状不同（见下表），在电场中移动速度不同。由表可知，血清中5种蛋白质的等电点大部分低于pH7.0所以在缓冲液（pH值8.6）中，它们都电离成负离子，在电场中向阳极移动。 蛋白质名称 白蛋白 α1–球蛋白 α2–球蛋白 β–球蛋白 γ–球蛋白 等电点（pI） 4.88 5.06 5.06 5.12 6.85～7.50 相对分子量/Mr 69 000 200 000 300 000 90 000～150 000 156 000～300 000; 在一定范围内，蛋白质的含量与结合的染料量成正比，故可将各蛋白质区带剪下，分别用0.4mol/LNaOH溶液浸洗下来，进行比色，测定其相对含量。也可以将染色后的薄膜直接用光密度计扫描，测定其相对含量。 本实验采用的醋酸纤维薄膜电泳，是以醋酸纤维薄膜为支持物的电泳方法。醋酸纤维素是纤维素的羟基乙酰化形成的纤维醋酸酯。将它溶于有机溶剂 (如：丙酮、氯仿、乙酸乙酯等)后，涂成均匀的薄膜，待溶剂蒸发后则成为醋酸纤维薄膜。该膜具有均一的泡沫状结构，有强渗透性、其厚度约为120μm。; 醋酸纤维薄膜电泳是近几年来推广的一种新技术。它具有微量、快速、简便、分辨力高、对样品无拖尾和吸附现象等优点。目前已广泛应用于血清蛋白、血红蛋白、糖蛋白、脂蛋白、结合球蛋白、同工酶的分离及测定方面。 三、器材 1、醋酸纤维薄膜(2×8 cm) 2、常压电泳仪 3、点样器(市售或自制) 4、培养皿(染色及漂洗用) 5、粗滤纸 6、玻璃板 7、竹镊 ;四、试剂 1． 硼酸缓冲液（PH8.6,离子强度0.075mol/L） 硼酸5.6025g，四硼酸纳5.6099g，氯化钠1.3163g，加蒸馏水至1000mL 2．染色液 300mL 含氨基黑10B 0．25 g，甲醇50 mL，冰醋酸10 mL,水40mL(可重复使用)。 3．漂洗液 2000mL 含甲醇或乙醇45 mL、冰醋酸5 mL、水50 mL。 4.透明液(现用现配） 无水乙醇:冰醋酸＝7:3 ;五、操作 1．浸泡 用镊子取醋酸纤维薄膜1张（8*2cm），识别出光泽面与无光泽面，并在角上用笔做上点样线（膜条一端1.5cm处，用铅???横画一条线）放在巴比妥缓冲液中浸泡20分钟。整条薄膜一致而无白点，则表明薄膜质地均匀(实验中应选择质地均匀的膜) ;;3．电泳 在电泳槽内加入缓冲液，使两个电极槽内的液面等高，将将点好样的薄膜 (无光泽面朝下)两端平悬于电泳槽支架的滤纸桥 (先剪裁尺寸合适的滤纸条，取双层滤纸条附着在电泳槽的支架上，使它的一端与支架的前沿对齐，而另一端浸入电极槽的缓冲液内。用缓冲液将滤纸全部润湿并驱除气泡，使滤纸紧贴在支架上，即为滤纸桥，它是联系醋酸纤维薄膜和两极缓冲液之间的“桥梁”。) 上。膜条上点样的一端靠近负极。盖严电泳室。平衡10min后，通电。调节电压至160V，电流强度0．4～0．7 mA／cm(毫安／厘米)膜宽，电泳时间约为60分钟。;4．染色 电泳完毕后将膜条取下并放在染色液中浸泡10分钟。 5．漂洗 将膜条从染色液中取出后移置到漂洗液中漂洗数次（3-4次，每次5min）至无蛋白区底色脱净为止，用滤纸吸取多余液体，可得色带清晰的电泳图谱。 6.透明 将干燥的电泳图谱膜条放入透明液中浸泡 2~3min后取出贴于洁净玻璃板上，干后即为透明的薄膜图谱，可用光密度计直接测定。;六、注意事项 1、 保持醋酸纤维素薄膜的清洁，避免用手直接接触薄膜。 2、 点样量要适宜，2次左右即可，盖玻片的边缘应避免出现明显液滴。点样要尽量点在一条直线上。（此步是实验的关键,点样前应在滤纸上反复练习,掌握点样技术后再正式点样。） 3、 电泳时间不低于1小时。 4、 点样处不要搭在滤纸上，以免血清渗入滤纸。 5、 醋酸纤维素薄膜应绷直，避免电泳槽隔离板的干扰。 6、 不可同时接触正负极，防止触电。;结果分析：;思 考 题