层析原理与技术知识讲稿.ppt

层析原理与方法;内容提要;什么是蛋白层析;分离机制;层析的基本概念;层析的基本概念;层析方法;Gel Filtration 凝胶过滤;凝胶过滤层析 /分子筛; 分子筛层析是利用有一定孔径范围的多孔凝胶作为固定相，对混合物中各组分按分子大小进行分离的层析技术。 具有分子筛作用的物质很多，如浮石、琼脂、琼脂糖、聚乙烯醇、聚丙烯酰胺、葡聚糖凝胶等。;1. Spherical particles packed into a column;凝胶过滤层析;Steric exclusion leads to early elution; 100 1,000 10,000 100,000 Bio-Gel P2 Bio-Gel P4 Bio-Gel P6 Bio-Gel P10 Bio-Gel P30 Bio-Gel P60 Bio-Gel P100;柱长的选择 分离：30－120cm 脱盐：30cm以下 洗脱液 离子强度;1.可分离相对分子量从几百到几十万的物质 具有3000个理论塔板的凝胶过滤可将分子量相差2倍的蛋白质完全分开,6000个理论塔板的可将分子量相差1.5倍的蛋白质完全分开;建议柱高在80-120cm,直径=H/30 2.脱盐;凝胶过滤层析;离子交换层析; 离子交换层析法是以具有离子交换性能的物质作固定相，利用它与流动相中的离子能进行可逆的交换性质来分离离子型化合物的一种方法。;cation;pI;Products: UNOsphere? Q S, Macro-Prep? High Q S, CM, DEAE, AG? resins ;;离子强度 洗脱时多采用离子浓度梯度,常加NaCl,KCl,LiCl等. 在不同盐浓度（离子强度）及其不同变化率（梯度）条件下保留行为不同，需对该条件进行摸索。一般的，随离子强度增加，蛋白质保留值减小。;pI＝5.5;;离子交换层析;疏水层析;基于生物分子表面疏水性不同而达到分离的技术 疏水作用来自于分子的水化结构，高浓度盐溶液破坏生物分子的水化结构，使蛋白质内部的疏水基团暴露于分子外表面，从而可与疏水介质结合 不同离子的疏水性 Anions: SO42- Cl- Br- NO3- ClO4- I- SCN- Cations: Mg2+ Li+ Na+ K+ NH4+ 蛋白质以高浓度盐溶液结合与疏水层析柱上，以低浓度盐溶液洗脱;疏水层析;作用原理;操作参数选择;Sample: GFP sample brought up to 2 M AS, filtered Load: 5 ml Buffer: A:2 M (NH4)2SO4+ 0.1 M NaP, pH 7 B: 0.1 M NaP, pH 7 Flow Rate: 3 ml/min (230 cm/hr);亲和层析;亲和层析是利用待分离物质和它的特异性配体间具有特异的亲和力，从而达到分离目的的一类特殊层析技术。 亲和层析纯化过程简单、迅速，且分离效率高。 ;Equilibration Sample application Binding and washing Desorption and elution;亲和层析;亲和层析;Profinity IMAC——纯化His-tagged Protein Chelex 100——纯化DNA，PCR样品制备 Affi-Gel Protein A——纯化单克隆抗体 Dye - Affi-Gel Blue (DEAE or CM) ——纯化单抗，分离HSA Affi-Gel 肝素凝胶——多种蛋白，如凝结因子、蛋白酶、核酸酶、脂酶 Affi-Gel Polymixin——去除内毒素（热原） Affi-Gel 硼胶——分离核苷酸、核苷、儿茶酚胺、糖类等小分子;Profinity IMAC Resins;不同 IMAC 介质纯化氨基肽酶(aminopeptidase)纯度比较;Profinity IMAC Resins 纯化 6?His-tagged protein;羟基磷灰石层析;Ca10(PO4)6(OH)2 5 个带正电荷的Ca离子对（C位点） 2 个磷酸三价离子，每个含有带6个负电荷的氧原子（P位点） 2 个羟基 于其他层析介质不同，CHT的骨架是化学反应的表面;蛋白质带正电氨基 经典的阳离子交换 用中性盐溶液 (NaCl) 或缓冲盐溶