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第5章 细胞融合与单克隆抗体 Cell fusion and Monoclonal antibody 学习须知 主要内容：细胞融合与单克隆抗体的制备原理与技术。 重点：细胞融合与单克隆抗体的制备原理与技术 难点：单克隆抗体的制备原理 前言 细胞融合(cell fusion)，又称体细胞杂交(somatic hyhridization)或细胞杂交(cell hybridization)，指在离体条件下用人工方法将不同种生物或同种生物不同类型的单细胞通过无性方式融合成一个杂合细胞的技术。 细胞融合技术的出现标志着细胞工程的诞生。 日本仙台大学医学系的Okata于1962年发现仙台病毒(Sendal virus)可诱发艾氏腹水瘤细胞融合成多核细胞体，开创了动物细胞融合的崭新领域。 1975年剑桥大学阿根廷学者Cesar Milstein将，在Geoger Konler建议下，用羊红细胞免疫过的小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞融合，得到了既能在体外无限繁殖又能产生特异性抗体的杂交瘤细胞。导致了免疫学技术的革命，并因此获得了1984年诺贝尔医学及生理学奖。 本章内容 5.1.单克隆抗体技术 5.2.人源单克隆抗体制备 5.3.单克隆抗体在医学上的应用 5.1.单克隆抗体技术 5.1.1 单克隆抗体技术的原理 5.1.2 杂交瘤制备 5.1.3 单克隆抗体的大量制备 5.1.1 单克隆抗体技术的原理 1. HAT选择原理 利用HAT选择性培养基结合突变细胞株来分离杂交瘤细胞。 DNA合成的2条途径： ①主要途径--生物合成途径（“D途径”） 糖、氨基酸→核苷酸→DNA，可被氨基蝶呤阻断。 胸腺嘧啶核苷激酶(TK+) ②补救途径（“S途径”） ： 核苷酸前体→核苷酸→DNA(RNA)， 补救途径的2个关键酶 次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(HGPRT+) 胸腺嘧啶核苷激酶(TK+) HAT选择性培养液是在普通的动物细胞培养液中加入次黄嘌呤（H）、氨基喋呤（A）和胸腺嘧啶核苷酸（T）。 在HAT培养液中，未融合的B淋巴细胞和B淋巴细胞的自身融合细胞的“主要途径”被氨基喋呤阻断，虽“补救途径”正常，但因B淋巴细胞缺乏在体外培养液中持续增殖的能力，一般10d左右会死亡。 在HAT培养液中，未融合的骨髓瘤细胞突变株（TK-且HGPRT+型或者是TK+ 且HGPRT-型）和骨髓瘤细胞突变株的自身融合细胞，其“主要途径”被氨基喋呤阻断，且自身的“补救途径”不正常（两种酶不可兼得），在HAT培养液中这类细胞也不能增殖而很快死亡。 惟有骨髓瘤细胞（TK-且HGPRT+型或者是TK+ 且HGPRT-型）与B淋巴细胞相互融合形成的杂交瘤细胞，既具有B淋巴细胞的“补救途径途径”，又具有骨髓瘤细胞在体外培养液中长期增殖的特性，因此能在HAT培养液中选择性存活下来，并不断增殖。 2 骨髓瘤细胞的选择： (1)HGPRT-突变体筛选方法：HGPRT特异性较差，补救途径合成DNA时，碱基类似物掺入DNA，而导致细胞死亡，使HGPRT+细胞全部死亡；而HGPRT-细胞因不会掺入这类嘌呤类似物而存活下来。 (2)TK-细胞筛选方法：同上。 5.1.2 杂交瘤制备 杂交瘤制备过程示意图 实验步骤(需几个月)： 动物免疫→ 细胞融合→ 选择杂交瘤→ 检测抗体→ 杂交瘤细胞的克隆化→ 冻存→ →体内接种或扩大培养，单克隆抗体(McAb)大量生产 1 细胞培养材料的准备 (1)培养基：常用两种。 DMEM，主要用于小鼠细胞融合； RPMI-1640，多用于制备人单克隆抗体。 配制，国内多用培养基干粉，去离子水或双蒸水直接溶解，过滤除菌后分装，4℃保存。 菌检，同时作细菌检验证明无菌。 配制完全培养基，使用前，添加适量胎牛血清或小牛血清、抗生素、谷氨酰胺等。 (2)血清 使用胎牛血清的原因：含较少球蛋白，对杂交瘤细胞分泌及筛选影响较少；含生长因子，促进杂交瘤细胞生长。 使用血清的注意事项：购置血清分装，保存于-20℃备用；使用前56℃水浴中灭活30min，破坏补体；灭活前，将血清置4℃或室温自然解冻； (3)污染处理，抗生素 细菌污染控制： 常规方法：青霉素和链霉素。 耐药菌株：庆大霉素或卡拉霉素 真菌污染抑制：难以防范 两性霉素B 或制霉菌素可抑制一些真菌生长。用量大会影响融合细胞生长。 支原体污染：非常隐蔽，预防困难。 防治：引入新的细胞应检测是否支原体污染；检测支原体阴性生长良好细胞，宜冻存一批备用；重要杂交瘤细胞被污染，可将细胞接种于小鼠体，清除污染支原体 2 免疫动物 目的：抗原刺激，B细胞分化增