酶学及酶工程课2章1节14.pptVIP

四. 多维核磁共振（NMR)技术 什么是核磁共振 NMR是以自旋量子数I=1/2的1H，13C，15N等原子的核为探针，检测分子结构信息的方法。 在外加静磁场（H0）作用下，自旋量子数不为0的原子核发生能级分裂。当同时将射频磁场H1作用其上，如频率满足关系式：ω＝γH0时，原子核吸收射频磁场能量由低能级跃迁到高能级，称核磁共振现象。其中γ为旋磁比，不同原子核的旋磁比不同，共振频率不同，而有氢谱，碳谱，氮谱之分。 核磁共振实验原理简介 在多维NMR实验中是以一串特定时间间隔的脉冲方式将H1作用到样品溶液上。在脉冲作用期间满足共振频率条件时，原子核吸收射频磁场能量。脉冲关闭后弛豫机制使核由高能态回到平衡态，接受线圈会感应出高频衰减信号，检波后再经傅立叶变换，形成核磁共振波谱。其中包含丰富的样品分子结构有关信息，可以正确地分析样品分子的二级结构和三级结构。 已有多种设计测定不同的结构信息。 测定的信息：波谱参数 1）化学位移 谱线化学位移来自于核外电子屏蔽作用。以系数σ描述所受屏蔽，共振条件公式变为： ω＝γ（1－σ ）H0 ，σ与分子结构及原子核所处化学环境有关。共振条件变化使谱线变化，称为化学位移。氨基酸中1H，15N和13C位于不同二级结构和三级结构中时，其谱线产生相应的化学位移。所以它们共振波谱的化学位移反映了蛋白质三维空间结构及局部微环境。 2）J 耦合常数 核磁距通过电子云间接传递作用产生能量耦合，反映被测核与周围原子核之间通过成键电子传递的磁相互作用。该耦合改变被测核共振条件，使谱线分裂为多重峰。谱线各分量距离表示耦合的强弱，定义为J耦合常数(Hz)。J耦合常数可用来描述蛋白质主链及侧链的构象。 3）NOE NOE，即欧沃豪斯效应，反映原子核自旋之间的偶极-偶极相互作用。蛋白质分子中1H-1H距离小于5?时，核磁共振氢谱中就可观察到NOE信号，强度和质子间距离6次方成反比。所以NOE信号强度提供了蛋白质中氢原子对之间的距离信息。 何为多维核磁共振 由于蛋白质的分子量很大，造成共振波谱加宽和重叠，无法提取结构信息。为充分地、正确地利用核磁共振波谱信息，发展了多维核磁共振技术，提供了多种有效获得结构信息的实验。 多维NMR共振信号是多个频率变量的函数，可有二维、三维或四维频率坐标轴。 5.核磁共振实验的材料准备 较高纯度的充足量蛋白质的获得。一般需要有10毫克级的纯蛋白量。 获得足够的稳定性。以在测定温度下有数天的溶液稳定性为好。同时溶液中要尽可能少含氢原子，一般需使用氘代化合物，如重水、氘代甘油。 制备13C，15N全标记蛋白。一般使用13C标记葡萄糖和15N标记氯化铵培养工程菌，表达制备所需蛋白质。 本次课结束 下次课再见！ Thank you！ 酶学及酶工程课2章1节14教材 谢谢 酶学及酶工程 Enzymology and Enzyme Engineering 田维熙 教授 中国科学院大学 第二章 酶的结构与功能 第一节 酶的空间结构及测定 一、原子间的作用力 1. 轨道和能级 轨道能级 生物常见原子电子轨道 2. 共价键——原子间最牢固的结合 σ键： 二个原子轨道上的电子均未成对； 分子轨道电子成对 成键轨道和反键轨道2个分子轨道； 形成成键轨道自由能降低； 正面形成σ键，键在二原子中心连线上。 碳原子电子轨道的杂化 碳原子的特点： 碳有4个外层电子2s2p可形成4个化学键，但只有2p两个单电子轨道，还有1个空p轨道； 2s和2p轨道能级很接近；成为形成杂化轨道条件。 能形成三种杂化轨道使碳原子可以和2，3或4个不同原子成σ键。 π键 π键是2个原子之间的第2或第3个键。形成π键需要2个原子均有和σ键垂直的p轨道未成对电子。 C-C, C-O, C-N之间均可形成π键。 π键特点：侧面成键，电子流动性大，键能比σ键低，并且不能自由转动。 共轭体系 符合形成π键条件的多个相邻原子可以形成大π键，称为共轭体系。在共轭体系中电子具有更大的流动性，这是很多反应的微观基础。 3. 离子键 酶分子上的电荷： 正电：来自 Arg, Lys, His, N端. 负电：来自 Asp, Glu, C端. 正负电荷形成的离子键是强作用力，对形成和维持酶的空间结构，以及酶和底物的相互作用，都起着重要作用。 F = q1q2 / Dr2 式中D为介电常数, q为电荷量, r为电荷间距。 4. 氢键 氢键在氢和高电负性的氧，氮原子间形成。 键能3－7千卡/摩尔。供、受体在一条直线上时强度最大。 水易形成氢键。 形成氢键的基团：1）作供体：吲哚基，胍基；2）作供体或受体：酰胺基，醇羟基；氨基，羧基，咪唑基。 5. 疏水作用 疏水作用是由水的作用形成的，并非疏水基团之间有吸引力。 水易形成4氢