蛋白质的修饰和表达.ppt

(3) 强的、可诱导的启动子 主要作用是促进转录的有效起始。原核细胞的启动子由-10区和-35区两部分组成。-10区是RNA聚合酶的牢固结合位点，-35区是RNA聚合酶的识别位点。 * ppt课件 (4) 强的转录终止序列 高效表达的载体应该含有终止子，因为合成的mRNA过长，不仅消耗细胞内的底物和能量，且易使mRNA形成妨碍翻译的二级结构。 * ppt课件 (5) 核糖体结合位点 原核微生物的mRNA结合核糖体的序列称为SD序列。SD序列对翻译效率有影响。 * ppt课件 (6) 合适的多克隆位点 具有多个单一酶切位点的多克隆位点，便于外源基因插入和筛选。 * ppt课件 2．与外源基因有效表达的相关因素 有效的转录起始 一个合适的高表达外源基因的启动子应符合以下几点：第一，必须是较强的启动子，表达效率在10-30%。第二，由启动子控制的本底转录很低。第三，启动子能够有一些简单及经济合算的方式诱导启动。 例如：T7启动子 * ppt课件 转录终止区对外源基因表达效率的影响 转录终止有两种机制，一种是依赖六聚体蛋白rho的rho依赖性转录终止，rho蛋白能使新生RNA转录本从模板脱离。另一种是rho非依赖性转录终止，它特异性依赖与模板上编码的信号。 贯穿启动子的转录将抑制启动子的功能，造成启动子的封堵。 * ppt课件 （3）mRNA稳定性的影响 mRNA的快速降解势必影响蛋白质的合成。 通常用非常强的启动子来弥补不稳定的mRNA的转录物。 * ppt课件 (4)密码子偏好性 遗传密码有64种，但是绝大多数生物倾向于利用其中一部分。那些被最频繁利用的称为最佳密码子，不被经常利用的称为稀有或利用率低的密码子。 富含E.coli不常用密码子的外源基因有可能在E.coli中得不到有效表达。精氨酸tRNA是多种哺乳动物基因在细菌中表达的限制因子。 * ppt课件 5、表达定位 外源蛋白可能定位于：胞内、胞质膜、胞周质、外膜和胞外培养基。 （1）表达的外源蛋白定位于胞外 小分子蛋白较易表达，产物接近天然蛋白；但表达大分子时，则易在胞内形成包涵体。 蛋白质在细胞质中被降解的可能性比其他的定位要大得多。 从细胞质蛋白混合物中纯化目的蛋白相对比较困难。 * ppt课件 （2）细胞外周质表达 有利于目的蛋白的纯化；有利于蛋白质的正确折叠；信号肽在细胞内剪切更有可能产生目的蛋白的天然N末端；蛋白质降解也少。 许多原核和真核细胞来源地信号肽已成功用于蛋白质从内膜到外周质的转运。如：E.coli的PhoA信号、人生长激素信号肽等。 * ppt课件 （3）细胞外分泌 易于纯化，减少降解 方法：a、利用已有的“真正”的分泌蛋白所采用的途径，b、利用信号肽序列、融合伴侣和具有穿透能力的因子。 * ppt课件 （4）外源蛋白表达定位在胞质膜上 形成具生物活性的膜蛋白，大肠杆菌内膜上表达定位的G蛋白偶联受体，已用于受体与配基的结合、G蛋白与效应物的偶联、受体自身的结构等。 * ppt课件 （5）表达外源蛋白定位于菌体表面 定位方式：a、将外源肽插入大肠杆菌外膜蛋白的膜外区，使一些短肽在细菌表面呈现。B、将外源蛋白序列插入菌体表面的结构，如鞭毛和菌毛的蛋白中。C、以菌体表面脂蛋白或Lpp-OmpA融合体作为靶向载体蛋白，将外源蛋白或肽序列与脂蛋白或Lpp-OmpA的N端或C端序列融合，表达定位于菌体表面。 * ppt课件 6、宿主选择对表达的影响 宿主菌对外源基因的表达会产生一定的影响。例如，菌株内源的蛋白酶过多，可能会造成外源表达产物的不稳定，所以一些蛋白酶缺陷型菌株往往成为理想的起始表达菌株。Rosetta 2系列可以补充大肠杆菌缺乏的七种稀有密码子对应的tRNA，提高了外源基因的表达水平。Origami 2系列是硫氧化还原蛋白还原酶和谷胱甘肽还原酶双突变菌株，显著提高细胞质中二硫键形成几率，促进蛋白可溶性及活性表达。 * ppt课件 7、培养条件的控制对表达效率的影响 蛋白质产量可以通过高细胞密度培养系统获得提高。 高密度培养系统可以分为：分批培养、补料分批培养和连续培养。 培养基的组分和培养参数会影响蛋白酶的活性、分泌和产量。 培养基的特殊操作能显著提高蛋白质释放到培养基中。如培养基中添加甘氨酸能增强外周质蛋白释放到培养基中。 * ppt课件 （三）真核基因在原核细胞中表达及调控 需注意：1、基因的编码区必须是连续的，因此要用切除内含子的cDNA。2、基因必须置于原核细胞的启动子、终止子和SD序列的控制之下，才能被宿主的转录与翻译系统有效识别。3、产生的mRNA必须相对稳定并能有效进行翻译和蛋白质折叠。 * ppt课件 二、目标蛋白质在酵母细胞中的表达 优点：1、既有原核表达系统操作简单、易于培养、生长速度快、表达量高、成本低等优点