大鼠骨髓间充质干细胞体外成骨诱导及体内异位成骨的实验研究-中西医结合基础专业毕业论文.pdf.docx

缩略词表英文缩写 缩略词表 英文缩写 英文全称 中文名称 ALP Alkaline Phosphatase 碱性磷酸酶 rpm Revolutions per Minute 每分钟转速 PBS Phosphate-buffered Solution 磷酸盐缓冲溶液 FITC Fouoresceln Isothiocynate 异硫氰酸荧光素 SPSS Statistical Program For Social 社会科学统计程序 p—TCP IB-tricalcium phosphate． p一磷酸三钙 MSCs Mesenchymal stem cells 间充质干细胞 Integratedoptical density 积分光密度 FBS Fetal bovine serum 胎牛血清 AA Ascorbic Acid 抗坏血酸 DEX Dexamethasone 地塞来松 16-GP p—91ycerophosphate p一甘油磷酸 45 泸州医学院硕士研究生 泸州医学院硕士研究生 学位论文独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及 取得的研究成果。学位论文中除了特别加以标注和致谢的地方外，不包含 其他人或其它机构已经发表或撰写过的研究成果。其他同志对本研究的启 发和所做的贡献均已在学位论文中作了明确的说明并表示了谢意。 学位论文作者签名： 签字曰期：妒留年厂月印日 泸州医学院学位论文版权使用授权书 本人完全了解泸州医学院有关保留、使用学位论文的规定，即： 泸州医学院有权保留并向有关部门或机构送交学位论文的复印件和磁盘， 允许论文被查阅和借阅。本人授权泸州医学院可以将学位论文的全部 或部分内容编入有关数据库进行检索，可以公布学位论文的全部或部分内 容，可以采用影印、缩印或其它复制手段保存学位论文，即：泸州医学院 具有学位论文的数字化制品复制权，信息网络传播权和汇编权。保密的学 位论文在解密后适用本授权书。 学位论文作者签名：诙一堀 导师签名： 可兰 签字日期：≯心年f月叩曰 签字日期：v。莎年孓月’∥Fj 大鼠骨髓问充质干细胞体外成骨诱导及体内异位成骨的 大鼠骨髓问充质干细胞体外成骨诱导及体内异位成骨的 实验研究 摘 要 目的：1．建立大鼠骨髓(bone marrow)间充质干细胞(mesenchymal ste mcells，MSCs)的体外培养体系，为MSCs深入研究提供实验模型；2．观察 大鼠MSCs在成骨培养条件下的生物学特征及体外成骨活性，为其作为骨 组织工程种子细胞提供初步的实验依据；3．构建大鼠MSCs与骨支架材料 复合物，观察大鼠MSCs在同系大鼠体内异位成骨能力，初步探讨其可能 机制，为MSCs作为骨组织工程种子细胞提供应用基础实验研究。方法：1． 大鼠MSCs分离及体外培养：取8w龄大鼠，体重为1009～1209，引颈处死 后，无菌条件下取出股骨和胫骨，基础培养基冲出骨髓，利用密度为1．07 7×1039／L的淋巴细胞分离液分离出大鼠骨髓中单个核细胞，以含10％FBS， lOOmg／L青霉素，100mg／L链霉素的LG-DMEM培养基进行原代培养(3 7C，5％C02)，3d后首次换液，待细胞长至lO～14d达到70％～80％融合 后传代，倒置相差显微镜下对其形态学特征进行观察，取传至第3代的M SCs应用流式细胞仪检测其表面分子CD44、CD45的表达情况；2．取第三 代大鼠MSCs，按照5×107／L的细胞密度制备细胞爬片，培养3天后除去培 养液，加入含10％FBS，100mg／L青霉素，100mg／L链霉素，10堪mol／L 的地塞米松，10mmol／L的6．甘油磷酸钠，50mg／L的抗坏血酸的LG—DM EM培养液在体外进行成骨诱导分化，倒置显微镜下观察诱导前后形态学 变化。诱导14天，钙钴法检测碱性磷酸酶表达；诱导21天，Von—Kossa 染色检测成骨情况，免疫荧光法检测I型胶原表达； 3．取第三代大鼠M SCs消化、离心，制成浓度为106细胞／mL细胞恳液，与骨支架材料多孔 SCs消化、离心，制成浓度为106细胞／mL细胞恳液，与骨支架材料多孔 p一磷酸三钙(p tricalcinm phosphate，13-TCP)__立方块(5mmx5mmx5mm，200 -4009m孔径， 95％多孔性)37。C共孵育2h，获得MSCs／[5．TCP复合物共 32枚，随机分成两组，每组16枚，分别以不同培养基培养，第1组为成 骨诱导组，采用含10％FBS，100mg／L青霉素，100mg／L链霉素，lO‘8 mol／L的地塞米松，10mmol／L的p．甘油磷酸钠，50mg／L的抗坏血酸的L G．DMEM培养液进行培养；第2组为未诱导组，采用含10％FBS，10