大鼠骨髓间充质干细胞体外培养及其分化为肝样细胞的实验研究-外科学专业毕业论文.pdf.docx

学位论文独创性声明本人呈交的学位论文系在导师指导下所取得的研究成果。除了文 学位论文独创性声明 本人呈交的学位论文系在导师指导下所取得的研究成果。除了文 中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰 写的研究成果，也不包含为获得广东医学院或其他教育机构的学位或 证书所使用过的材料。 作者签名： 日期：啦幽 学位论文知识产权声明 本人在就读研究生期间所完成的学位论文及其相关成果，知识产 权归属学校。本人在毕业离校前会将有关的研究资料和结果全部上交 导师，离校后发表或使用学位论文或与该论文直接相关的学术论文或 成果时，署名单位仍然为广东医学院。学校可以将学位论文的全部或 部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复 制手段保存、汇编学位论文，可以公布(包括刊登)论文的全部或部 分内容。导师享有发表学位论文、申请成果和专利的权利。 注：保密的学位论文在解密 作者签名： 日期：进勘 导师签名： 日期：趁竺星二￡，，握 大鼠骨髓间充质干细胞体外培养及其分化为 大鼠骨髓间充质干细胞体外培养及其分化为 肝样细胞的实验研究 中文摘要 目的 建立骨髓间充质干细胞(bone marrow derived mesenchymal stem cells, BM．MSCs)体外分离纯化的方法，探讨联合应用肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor,HGF)和粒细胞集落刺激因子(granulocyte colony stimulating factor, G．CSF)诱导BM．MSCs分化为肝样细胞的可行性。 方法 1、BM．MSCs分离、纯化：无菌条件下抽取2周龄SPF级SD大鼠股骨和胫 骨的骨髓细胞，根据BM．MSCs与其他细胞贴壁性的差异，通过换液、传代达到 分离纯化细胞目的； 2、BM-MSCs的鉴定：从细胞贴壁性、免疫表型检测(CDl4、CD34、CD90) 及分化为脂肪细胞三方面进行细胞； 3、BM-MSCs向肝样细胞分化：(1)实验分组：①Go组：不添加任何因子， 设立阴性对照；②Gl组：20ng／ml HGF，阳性对照组；③G2 ：20ng／ml HGF+5ng／ml G-CSF：④G3组：20ng／nll HGF+10ng／ml G-CSF；⑤G4组：20ng／ml HGF+20ng／mi G-CSF：(2)诱导分化：取P5细胞，待其90％融合后，胰酶消化，调整细胞密 度为2x105／ml，按实验分组接种于6孔板中，每隔3天换液一次；(3)肝样细胞 鉴定：①细胞功能检测：选取诱导第7、14天的细胞进行PAS染色，检测糖原 合成、分泌情况；②细胞标记物检测：选取诱导第7、14、21天的细胞，提取 RNA，RT-PCR半定量检测AFP mRNA和ALB mRNA的表达水平。 4、统计学数据均用均数4-标准差(i士s)表示，采用SPSSl3．0软件处理， 方法是单因素方差分析和g检验法，检验标准a=O．05。 结果 1、获得高活力的均质BM．MSCs，细胞呈梭型，辐射状、涡旋状分布，台盼 蓝拒染活细胞计数法显示，细胞存活率可达95％以上； 2、链霉亲和素．生物素．过氧化物酶复合物(SABC法)检测显示，细胞阳性 2、链霉亲和素．生物素．过氧化物酶复合物(SABC法)检测显示，细胞阳性 表达CD90(阳性染色率96％,-97．2％)，造血祖细胞和内皮细胞标记物CD34和 巨噬细胞和单核细胞显著表达的CDl4，几乎不表达(阳性染色率1．5％)，说 明获得细胞中几乎不包含以上几种常见的混杂细胞，BM．MSCs纯度高。 3、在成脂条件培养基诱导下，细胞第5日即有脂肪滴形成，脂滴逐渐增大、 融合，油红O染色后，脂肪被染成橙红色，提示阳性染色； 4、Gl如组条件培养基诱导后，部分细胞死亡、脱落，存活细胞的胞体逐 渐回缩成圆形或多角形，贴壁能力减弱，扩增速度减慢，局部出现群聚，以G3、 G4明显。G0阴性对照组的细胞形态未见明显变化； 5、Gl如组诱导第7、14天的细胞PAS染色，均见胞浆红染颗粒，Go对照 组未见阳性染色；同一时间点，G1．4组间阳性染色率差异有统计学意义(户．0．05)， 其中Gl与G2，G3与G4比较，差异均无统计学意义(Po．05)，阳性染色率差异 不明显；G3、G4与G2比较，差异有统计学意义(P0．05)，G3、G4组阳性染色 率较高。以上结果提示：G1．4几种方案诱导后的细胞均能合成、分泌糖原，联合 应用HGF和GCSF诱导后的细胞糖原染色率较高，其中G-CSF的适宜浓度为 10ng／ml，G-CSF浓度提高到20ng／na并不能提高PAS阳性染色率，低浓度的 G-CSF(5ng／m1)也不能发挥其联合诱导中的协同作用； 6、RT-PCR测定诱导后的细胞AFP