第六章光学检测技术-张静.ppt

第六章 光学检测技术 利用物质所具有的各种光学性质，对物质进行定性、定量及结构分析的技术。 包括：旋光检测、荧光检测、分光光度检测、散射光谱检测等。 生化领域常用：分光光度检测、旋光检测、荧光检测 第一节 旋光检测技术 利用旋光计测量出旋光物质（光学活性物质）对偏振光旋转角度的方向（左旋或右旋）和大小，从而进行定性与定量分析的技术，称为旋光检测技术。 旋光物质对偏振光的旋转方向和角度大小是该物质的固有特性。偏振光旋转的方向和角度称为旋光度。左旋（－），右旋（＋）。 物质的旋光度主要取决于物质本身的结构，此外与入射光的波长及温度有关，对溶液而言，还与溶液性质、溶液浓度和溶液厚度有密切关系。 旋光法：应用旋光仪测量旋光性物质的旋光度以确定其含量的分析方法。 光是一种电磁波，即光波的振动方向与其前进方向互相垂直。自然光有无数个与光的前进方向互相垂直的光波振动面。若光线前进的方向指向我们，则与之互相垂直的光波振动平面可表示为如图（a），图中箭头表示光波振动的方向。若使自然光通过尼科尔棱镜，由于振动面与尼科尔棱镜的光轴平行的光波才能通过尼科尔棱镜，所以通过尼科尔棱镜的光，只有一个与光的前进方向互相垂直的光波振动面，如图（b）。这种仅在一个平面上振动的光叫偏振光。 通常用以下两种方法产生偏振光：尼科尔棱镜或偏振片。 尼科尔棱镜 一块方解石的菱形六面体末端的表面磨光，使镜角等于68°，将之对角切成两半，把切面磨成光学平面后，再用加拿大树胶粘起来，便成为一个尼科尔棱镜。其中非常光线MP由方解石到加拿大树胶是由光疏介质到光密介质，必将发生折射通过加拿大树胶，由棱镜的另一端面射出，从而产生了平面偏振光。 旋光性、旋光性物质 分子结构中有不对称碳原子，能把偏振光的偏振面旋转一定角度的物质称为光学活性物质。许多食品成分都具有光学活性，如单糖、低聚糖、淀粉以及大多数的氨基酸和羟酸等。其中能把偏振光的振动平面向右旋转的，称为“具有右旋性”，以（十）号表示；反之．称为“具有左旋性”，以（一）号表示。 旋光度 偏振光通过光学活性物质的溶液时，其振动平面所旋转的角度叫做该物质溶液的旋光度，以α表示。旋光度的大小与光源的波长、温度、旋光性物质的种类、溶液的浓度及液层的厚度有关。对于特定的光学活性物质，在光源波长和温度一定的情况下，其旋光度α与溶液的浓度c和液层的厚度L成正比。 即： 比旋光度 当旋光性物质的浓度为 100 g/100 ml，液层厚度为 l dm（分米）时所测得的旋光度称为比旋光度，以 表示 。由上式可知： ＝K×1×1＝K 即： ＝ 式中： [α]－－比旋光度，度； t －－ 温度， λ－－光源波长，nm； α－－旋光度，度； L－－液层厚度或旋光管长度，dm； c－－溶液浓度，g／ml。 比旋光度与光的波长及测定温度有关。通常规定用钠光D线（波长 589.3nm）在20℃时测定，在此条件下，比旋光度用 表示 因在一定条件下比旋光度 是已知的，L为一定，故测得了旋光度就可计算出旋光质溶液中的浓度c。 变旋作用 定义 具有光学活性的还原糖类（如葡萄糖，果糖，乳糖、麦芽糖等），在溶解之后，其旋光度起初迅速变化，然后渐渐变得较缓慢，最后达到恒定值，这种现象称为变旋作用。 这是由于有的糖存在两种异构体，即α型和β型，它们的比旋光度不同。这两种环型结构及中间的开链结构在构成一个平衡体系过程中，即显示出变旋光作用。 旋光仪 WXG型半荫旋光仪 检糖计 WZB自动旋光仪 WGX型半荫旋光仪 结构和原理 起偏棱镜一般用尼科尔（Nicol)棱镜，以获得偏振光。 旋光管盛装待测液的玻璃管。 检偏棱镜仍用尼科尔（Nicol)棱镜，用以检测从旋光管射出的偏振光振动平面与原来相比较的角度（可由刻度盘上的数值读出）。 检糖计 检糖计专用于糖类的测定。故刻度数值直接表示为蔗糖的百分含量（W/V），其测定原理与旋光计相同。在结构上有以下特点 自动旋光仪 第二节 荧光检测技术 物质被辐射能照射后，分子内部获得外源能量，基态分子能级的电子跃迁到较高能级，转变成激发态分子能级，使分子处在高能域不稳定状态，因此，它必须释放多余的能量，变成稳定状态的分子。 分子发光：由激发态能级回