乳与乳制品微生物检验方法染色技术.doc

乳与乳制品微生物检验方法染色技术 YLNB 3.8 1、染色的基本原理 等电点学说：细菌的等电点较低，pH值大约在2～5之间，故在中性、碱性或弱酸性溶液中，菌体蛋白质电离后带阴电荷，而碱性染料电离时染料离子带阳电。因此，带阴电的细菌常与带阳电的碱性染料进行结合。所以，在细菌学上常用碱性染料进行染色。 通透性学说：革兰氏阴性菌与革兰氏阳性菌均让结晶紫染色液与碘液通过，进入菌体后，碘液与染料结合成一种不溶于水，只溶于酒精的化合物，这种化合物能渗出革兰氏阴性菌体外而不能渗出革兰氏阳性菌体外，这样革兰氏阳性菌仍保留结晶紫和碘化合物的颜色而呈紫色，而革兰氏阴性菌则被脱色，复染后呈复燃的粉红色。 2、制片和染色的基本程序 制片 干燥 固定 染色 媒染 脱色 复染 水洗 干燥 镜检 2.1 制片 在干净的载玻片上滴一滴生理盐水，，用接种环进行无菌操作，挑取培养物少许，置载玻片的水滴中，与水混合做成悬液并涂成直径约1cm的薄层，为了避免因菌数过多聚成集团，不利观察个体形态，可在载玻片之一侧再加一滴水，从已涂布的菌液中再取一环于此水滴中进行稀释，涂布成薄层。若材料为液体培养物，则直接涂布于载玻片上即可。 2.2 自然干燥 涂片可在室温下自然干燥，也可在酒精灯上轻过几次，使水分蒸发，但切勿加热时间过长，温度过高，以防标本烤枯而变形。 2.3 固定 一般均用加热法，手执载玻片的一端（涂有标本的远端），标本向上，迅速通过酒精灯火焰外层2～3次，共约2～3秒钟，温度以载玻片反面接触皮肤，热而不烫为宜（不超过60℃）。放置待冷后，进行染色。 2.4 染色 标本固定后滴加染色液。染色的时间各不相同，视标本与染料的性质而定，有时染色液还需加热。染料作用标本的时间平均约1～3分钟，而所有的染色时间内整个有标本的部分都应浸在染液中。 若做复合染色，在媒染处理时，媒染与染料形成不溶性化合物，可增加染料和细菌的亲和力。一般固定后媒染，但也可以结合固定或染色同时进行。 2.5 脱色 用醇类或酸类处理染色的细胞，使之脱色。可检查染料与细胞结合的稳定程度，鉴别不同种类的细菌。常用的脱色剂是95%的乙醇和3%的盐酸溶液。 2.6 复染 脱色后再用一种染色剂进行染色，与不被脱色部位形成鲜明的对比，便于观察。 2.7 水洗 染色到一定的时候，用细小的水流从标本的侧面把染料冲掉，被菌体吸附的染料则被保留。 2.8 干燥 着色标本洗净后，将标本晾干，或用吸水纸把多余的水吸干，然后晾干或为热烘干，用吸水纸时，切勿使载玻片翻转，以免将菌体擦掉。 2.9 镜检 3、染色液配制及染色法 3.1 吕氏美兰染色法 3.1.1染液的配制 吕氏美蓝染三色液： 美蓝 0.3g 95%体积分数的乙醇 30ml 0.1g/L氢氧化钾溶液 100ml 将美蓝溶解于乙醇中，然后与氢氧化钾溶液混合。 3.1.2 染色方法 将涂片干燥后热固定，待冷。滴加染液，染1～3分钟，水洗，待干，镜检。 3.1.3 观察结果：菌体呈蓝色。 3.2 革兰氏染色法 3.2.1 染液的配制 a．结晶紫染色液： 结晶紫 1g 95%体积分数的乙醇 20ml 10g/L草酸铵水溶液 80ml 将结晶紫溶解于乙醇中，然后与草酸铵溶液混合。 b．革兰氏碘液： 碘 1g 碘化钾 2g 蒸馏水 300ml 将碘与碘化钾先进行混合，加入蒸馏水少许，充分振摇，待完全溶解后，再加蒸馏水至300ml。 c．沙黄复染液： 沙黄 0.25g 95%体积分数的乙醇 10ml 蒸馏水 90ml 将沙黄溶解于乙醇中，然后用蒸馏水稀释。 3.2.2 染色方法： 将涂片干燥后，在火焰上热固定； 滴加结晶紫染色液，作用1分钟，水洗； c．滴加革兰氏碘液，作用1分钟，水洗； d．滴加95%体积分数的乙醇脱色，约30秒；或将乙醇滴满整个涂片，立即倾去，再用乙醇滴满整个涂片，脱色10秒，水洗； e．滴加沙黄复染液，作用1分钟，水洗，待干，镜检。 3.2.3 观察结果：革兰氏阳性菌呈紫色；革兰氏阴性菌呈红色。 3.3 夹膜染色法 3.3.