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第五章 双水相萃取技术 (Aqueous Two Phase Extraction) 双水相萃取(aqueous two-phase partitioning) 是1896 年Beijerinck 把琼脂和可溶性淀粉或明胶相混合时最早发现的。1956年，瑞典伦德大学的Albertsson重新发现此体系并第一次用来提取生物物质。1979年，Kula和Kroner等人将双水相体系用于从细胞匀浆液中提取酶和蛋白质，使胞内酶的提取过程大为改善。此后，对于双水相体系的研究和应用逐步展开并取得很大进展。在提纯有生理活性的生物物质方面，与其他提取方法相比，它具有许多优势。现在双水相萃取已被广泛用于蛋白质、酶、核酸、病毒、细胞、细胞器等生物产品的分离和纯化，并逐步向工业化生产迈进，展现了在食品工业、生物学研究和生物工程方面的巨大应用前景。 一、双水相萃取的基本特性 2 种天然的或合成的亲水性聚合物的水溶液相互混合时，最常见的现象是，由于2 种聚合物间存在较强的斥力或空间阻碍，使2者无法相互渗透，不能形成均一相，故达到平衡后形成两相，这2 种聚合物分别位于互不相溶的两相中，即形成聚合物/聚合物双水相体系。另外，某些聚合物溶液和一些无机盐溶液相混时，在一定浓度下，由于盐析作用，也会形成两相，即聚合物/ 无机盐双水相体系，常用的无机盐有磷酸盐和硫酸盐。除高聚物、无机盐外，能形成双水相体系的物质还有高分子电解质、低分子量化合物。 可形成双水相的双聚合物体系很多，如聚乙二醇(polyethylene glycol, PEG)/葡聚糖(dextran，Dx)，聚丙二醇(polypropylene glycol) / 聚乙二醇和甲基纤维素(methylcellulose)/葡聚糖等。双水相萃取中常采用的双聚合物系统为PEG/Dx，该双水相的上相富含PEG，下相富含Dx。除双聚合物系统外，聚合物与无机盐的混合溶液也可形成双水相，例如，PEG/磷酸钾(KPi)、PEG/磷酸铵、PEG/硫酸钠等常用于生物产物的双水相萃取。PEG/无机盐系统的上相富含PEG，下相富含无机盐。 常用的双水相体系是聚乙二醇(PEG)/葡聚糖(dextran) 体系和PEG/磷酸盐体系。PEG/dextran体系一般用于小规模地分离生物大分子、膜、细胞等，PEG/无机盐体系主要用来大规模地提纯酶，这是因为PEG/无机盐体系的萃取专一性更高，葡聚糖价格昂贵的缘故。 物质在两相中的选择性分配是疏水键、氢键和离子键等相互作用的结果，可溶性物质的分配情况可由分配系数K来表征，细胞这些更大颗粒的分配情况则由分配比P来表征。影响蛋白质及细胞碎片在双水相体系中分配行为的主要参数有成相聚合物的种类、成相聚合物的分子质量和总浓度、无机盐的种类和浓度、pH值、温度等。 双水相萃取的基本特点 (1) 体系有生物亲和性。两相中的水分含量通常高达65%～90% ，所用的PEG、dextran等高聚物或磷酸盐、硫酸盐等无机盐对蛋白质、核酸等生物活性物质无毒害，甚至还有稳定保护作用，而且相界面张力比水-有机或有机-有机两相体系的界面张力要小1～3 个数量级。由于生物活性物质在有机溶剂中易变性，再加上有的生物活性物质亲水性很强，不溶于有机溶剂，有机溶剂萃取等分离技术难以在生物活性物质的分离中发挥其效能。 (2) 与常用的亲和层析相比，双水相萃取能够在较少的溶液量和较短的操作时间内获得较高产量的产品。另外，操作能够容易、精确地按比例放大，非常适合大规模应用，可进行连续生产。而亲和层析由于操作难于放大，应用受到限制。 (3) 聚合物的浓度和分子质量、无机盐的种类和浓度、pH 以及温度等均能影响被分配物质在两相间的分配，所以操作容易进行控制，进而达到目的产物的最佳萃取条件。 (4) 可与细胞破碎相结合，即细胞悬浮液中加入PEG和无机盐后再通入珠磨机进行破碎，然后用离心机分相。既节省了萃取设备和时间，又避免了胞内酶的损失。 (5) 能进行萃取性的生物转化。在一些双水相体系中可将发酵生产过程中的生物转化与下游处理的第1步相结合，即生物反应在其中一相中进行，同时生成的反应产物被连续萃取到另一相中。不仅解决了产物反馈抑制作用造成的产量低的问题，而且酶在高聚物溶液中比在缓冲液中更稳定，活性更大。因为生物反应和生物产物的提取同时进行，尤其适于连续生产。 (6) 亲和萃取(亲和分配) 可大大提高分配系数和萃取专一性。由于目标蛋白质与其他杂蛋白的理化性质相近，造成其萃取专一性不高。亲和萃取就是将一种和目标蛋白质有很强亲和力的配基与一种成相聚合物共价结合，该成相聚合物与另一种成相聚合物形成双水相体系进行萃取时，目标蛋白质专一性地进入结合有配基的那种成相聚合物所在相中，其它杂蛋白则进入另一相。此技术已用于乙醇脱氢酶、丙酮酸激酶和核酸内切酶等