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第13章  程序性细胞死亡与细胞衰老 第一节 程序性细胞死亡 第二节 细胞的衰老 第一节 程序性细胞死亡 一、细胞凋亡(apoptosis) 二、细胞坏死(necrosis) 三、细胞自噬(autophagy) 一、细胞凋亡 细胞凋亡 (apoptosis)：主动性细胞死亡，由基因控制的自杀性程序死亡过程。主要发生在胚胎发育过程中，是程序性细胞死亡 (programmed cell death，PCD)的主要方式。 动物细胞凋亡经历：凋亡的起始、凋亡小体形成、凋亡小体被邻近细胞所吞噬和消化几个连续过程。 动物细胞凋亡的过程 (一) 细胞调亡的生理意义 动物机体靠对细胞增殖和细胞周期的正负控制以及对程序性细胞死亡的正负控制来维持细胞总数的平衡和机体的生命活力。 胚胎发育过程中，器官的形成以及形态构建存在细胞的凋亡。如指和趾的形成、无尾两栖类尾的退化等。 成体中通过细胞凋亡清除不再需要的细胞、部分被病毒感染的细胞、某些肿瘤细胞和衰老的细胞等，而不引起炎症反应。 (二) 细胞凋亡的检测方法： 形态学观测：利用DAPI(4’,6-二眯基-2-苯基吲哚)与DNA特异性结合或Giemsa使染色质着色，在荧光显微镜或普通光学显微镜下观察染色质固缩、趋边、凋亡小体的形成等凋亡过程。也可在电镜下观察到染色质固缩、凋亡小体的形成、细胞发泡等现象。 DNA电泳：细胞凋亡时，染色质DNA在核小体间被特异性切割，DNA降解成180～200bp或其整倍片段。提取凋亡细胞DNA进行电泳，可出现200bp DNA梯状条带。DNA ladder仍然是鉴定细胞凋亡最简便可靠的方法。 TUNEL测定法(DNA断裂的原位末端标记法)：末端脱氧核苷酸转移酶介导的dTUP缺口末端标记测定法(terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick end labeling)。借助可观测的标记物(如荧光素)对凋亡细胞的核DNA中产生的3’-OH末端进行原位标记，用荧光显微镜进行观察。 彗星电泳法：单个细胞在琼脂糖凝胶中，经裂解处理后，再在电场中短时间电泳，并用荧光染料染色。由于凋亡细胞DNA的降解片段在电场中泳动速度较快，使细胞核呈现出彗星式图形，而正常细胞无DNA断裂，泳动速度一致保持圆球形。 流式细胞分析：由于细胞凋亡过程中发生DNA的断裂和丢失，细胞内DNA含量为亚二倍体状态，用荧光染料PI染色后在流式细胞仪上可检测出凋亡的亚二倍体细胞。 细胞凋亡的普通光学显微镜观察 细胞凋亡的荧光显微镜观察 TUNEL测定法检测细胞凋亡 彗星电泳法分析细胞凋亡 流式细胞分析细胞凋亡 (三) 细胞凋亡的分子机制 2002年生理学或医学奖授予在器官发育和细胞凋亡中做出杰出贡献的三位科学家。 1. 胱天蛋白酶(Caspase) 2. Caspase依赖性的细胞凋亡 3. Caspase非依赖性的细胞凋亡 4. 细胞凋亡的调节 诱导细胞凋亡的因子大致可分为两大类：①物理性因子，包括射线、温度刺激等。②化学及生物因子，包括活性氧基团和分子、钙离子载体、视黄酸、细胞毒素、影响DNA和蛋白质合成的抑制剂、细胞凋亡因子(TNF)等。 所有动物细胞具有类似的凋亡机制，主要分为caspase依赖途径和caspase非依赖途径。细胞受到凋亡信号的刺激时，一般两条途径同时启动。 1. 胱天蛋白酶(caspase) ◆胱天蛋白酶 (caspase) 为一类天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白水解酶，其活性中心为半胱氨酸残基，水解底物的位点为天冬氨酸残基后的肽键，即Asp-X； ◆Caspase最早在秀丽隐杆线虫中发现， ced-3 和ced-4是细胞凋亡的必需基因，而ced-9可抵消ced-3和ced-4 的作用，防止细胞凋亡，因此ced-9抑制细胞凋亡; ◆ Ced3在哺乳动物细胞中的同源蛋白是白介素-1?转换酶(ICE)。ICE后被命名为Caspase-1，它催化白介素-1?前体的剪切成熟。 哺乳动物细胞caspase家族成员及其在细胞凋亡过程中的功能 ◆哺乳动物的Caspase家族分为两类：凋亡起始者：位于凋亡通路的上游，包括Caspase-2, 8, 9, 10, 11；凋亡执行者：在通路下游起凋亡执行作用，包括caspase-3, 6, 7等。起始者负责对执行者的前体进行切割，从而产生有活性的执行者；执行者负责切割细胞核内、细胞质中的结构蛋白和调节蛋白。 ◆细胞凋亡过程可分为激活期(activation phase)和执行期(execution phase)两个阶段。激活期细胞应答死亡信号，起始Caspase活化；执行期执行Ca