基因扩增检测实验及结果分析.doc

基因扩增检测实验及结果分析 1、目的：保证扩增及结果分析的标准化、规范化。 2．适用范围：适用于本室使用的普通离心机。 3．负责人：谢秋华 操作人：谢秋华 胡锦辉 何小雪 4、标准程序： 4.1 基因扩增检测标准程序：扩增反应前须先在样本输入模板上按照事先排好的标本位置进行设置。每次实验除待检标本，还需包括：阴性对照、阳性对照（室内质控品高低值各一份），一组阳性标准品（4个梯度108、106、105、104）。 4.1.1打开电脑电源开关，进入Windows NT界面。 4.1.2 接着打开PCR仪电源开关，预热5分钟。 4.1.3双击电脑桌面的ABI Prism 5700 SDS Software图标进入程序设置界面。 4.1.4单击 “文件”菜单中的 “新建”命令，（或单击工具栏中的“新建”按扭）。在测定、容器和模板中做相应的选择，点击OK。 4.1.5应用检测管理程序，并将其添加到样品板文档中。 4.1.6检测反应管， 4.1.7 根据当次实验所需条件编辑时间和温度。运行样品板文档。 4.2 结果分析标准程序 ： 应按以下步骤进行：全部曲线——阴性对照——阳性对照——阳性室内质控品——阳性标准品——逐个分析（标出阳性标本和可疑标本）——调整参数，获得较好的标准曲线，显示定量结果——登记，发报告。 4.2.1 整体曲线的观察：将所有曲线选中进行整体观察 1）观察是否存在污染情况（包括标本污染和试剂污染），特别应注意大量曲线 在同一Ct值出现上涨的情况。 2）观察是否有光路传导阻滞或电压波动等机器原因形成的异常曲线。 4.2.2 阴性对照的分析 阴性对照：试剂中加入与待检标本进行同样处理的已知阴性标本。 作用：用以监测实验室和前处理过程中是否存在污染。 4.2.3 阳性对照的分析 阳性对照：试剂中加入与待检标本进行同样处理的已知阳性标本。 作用：用以监测实验能否正常检出阳性标本，避免假阴性的出现。 4.2.4 室内质控品的分析 室内质控品：试剂中加入与待检标本进行同样处理的已知浓度室内质控品。 作用：用以监控日常实验的精密度。 4.2.5 阳性标准品的分析 1）各梯度曲线的分布是否均匀，若各梯度曲线均未分开，则表明阳模稀释可能存在问题，提示实验中存在较大人为误差。 2）观察各曲线的Ct值是否在平日的正常位置。 情况1：若出现低拷贝标准品做不出，而各曲线Ct 值均后移，则判断是否为试剂扩增效率下降（如试剂过期或保存条件不合格）。 情况2：出现低拷贝标准品做不出，而高拷贝曲线Ct值均正常，则提示可能存在低拷贝阳性标准品的降解情况。 3）每日必做104标准品，用作以下三方面监控：一是否存在操作误差，如加样量过少等原因导致104标准品未能检出；二是否存在稀释后的梯度放置过久，低拷贝标准品降解的情况；三是若高拷贝标准品出现Ct值后移，且能排除情况1、2，则判断是否为试剂灵敏度下降。 4.2.6 单个曲线的判断：逐个分析每条曲线，判断曲线的阴阳性或属可疑曲线。（可疑标本是指曲线在25个Ct值后出现上涨且平台趋势不明显或上涨幅度比较低的标本。可疑标本要第二天重做，两次结果一致则报阳性，否则结果报阴性。） 曲线观察内容：在基线选择2～8时观察荧光强度（是否有三期特征）。并分别在Delta Rn vs.Cycle 、Ct vs.Well Number和 Rn vs.Cycle这三种扩增图形式下分析数据。 4.2.7 得出定量结果：调节基线和阈值以得到一较好的标准曲线。电脑据此曲线给出阳性结果值。此时应排除某些阴性标本因荧光曲线假性上扬而得出的假阳性结果和某些弱阳性标本因终末荧光值过低而显示的假阴性。 4.2.8 发放报告：及时登记检测结果记录，发放临床报告。 4.3实验结果无效的判断标准：出现下述四种情况中的任何一种或多种，当次实验结果不可发，查找原因，重做实验。 4.3.1 阴性对照出现扩增。 4.3.2 阳性对照无扩增。 4.3.3大批甚至所有的标本都扩增了。 4.3.4 室内质控血清检测结果出现失控情况，实验失控的具体标准详见室内质控标准操作程序。 4.4实验结果有效的判断标准：达到下列要求后，当次实验有效，可以发放结果。 4.4.1阴性对照没有扩增，阳性对照扩增。 4.4.2阳性标准品梯度曲线平滑均匀，斜率、截距和相关系数三个参数的数值均在范围内。 4.4.3室内质控血清检测结果处于在控状态，具体标准详见 5. 本文涉及以下表格 室间质评记录表 PCR室内质控记录表 室内质控图