第六章DNA序列多态性分析.ppt

第六章DNA序列多态性分析 （Analisis of Sequence Polymorphism） 一、掌握DNA序列多态性概念；了解DNA序列测定及多态性分析基本技术。熟悉法医学应用价值评价。 二、了解等位基因特异性探针杂交技术基本原理、技术及方法、常用遗传标记系统。 三、了解扩增片段限制性长度多态性（PCR-RFLP）分析的基本原理、技术、方法及常用遗传标记系统、法医学应用。 四、了解MVR-PCR序列多态性分析技术的基本原理技术，常用遗传标记系统、基本分型方法及法医学应用。 五、了解序列多态性的其他分析技术。 核染色体STR分型局限性 作案现场只发现有头发或长期暴露于外界环境的骨骼，这些检材中核DNA含量很少或降解，无法进行STR分型。 DNA序列多态性（DNA sequence polymorphism） 概念：基因组DNA核苷酸序列在不同个体间最本质的遗传差异，在特定的基因座上不同个体的等位基因之间由碱基序列差异构成的DNA多态性叫做序列多态性。 同一个体的不同组织细胞中的基因组DNA序列是相同的，这是根据DNA序列认定同一性的前提条件。 主要包括线粒体序列多态性和核基因组单核苷酸多态性。 人类基因组计划完成，序列多态性的研究将成为新兴热点。 序列多态性的检测方法 经典测序技术（双脱氧核苷酸链终止法和化学裂解法) 等位基因（序列特异性）寡核苷酸 探针杂交（ASO-PCR）技术 扩增限制性片段多态性技术( PCR-RFLP ) 序列多态性分析技术（ MVR-PCR ） DNA芯片(DNA Chip) 基质辅助激光解吸附电离飞行时间质谱（ MALDI-TOF-MS） 变性高效液相色谱法(TmHPLC) 焦磷酸测序技术 微测序方法 实时荧光定量PCR技术 法医学上常用的序列多态性分析技术 DNA序列分析——mtDNA分型 PCR-ASO技术——HLA-DQAl 基因座 PCR-RFLP技术——ABO基因、 mtDNA 第一节 双脱氧核苷酸链终止法测序 Sanger测序及其改进方法 Sanger双脱氧末端终止法 （32P标记、放射自显影） 技术路线与要求 Sanger双脱氧末端终止法测序过程 1.用M13噬菌体做载体获得单链DNA模板，克隆并扩增待测DNA片段，使其变性。 2.选择一条与DNA单链互补的短链引物，引物先同单链模板复性 3.引物的延长和合成阻断 4个试管分别加入：模板、DNA聚合酶、dNTP-标记底物（32P等） 终止剂不同 ddATP ddGTP ddCTP ddTTP 4个试管中所有产物是一系列长度只差一个核苷酸的聚合链 4.电泳： ACGT次序 4道凝胶高压电泳 5.放射自显影得到直读图谱。 　链终止法对DNA多聚酶的要求 测序的DNA多聚酶 将DNA克隆到M13噬菌体载体 PCR产生单链DNA 引物决定模板链的测序起点 Sequencing of DNA by the Sanger method (Layer 1) Sequencing of DNA by the Sanger method (Layer 2) Sequencing of DNA by the Sanger method (Layer 3) 操作繁琐（准备模板、4管反应、4道电泳） 效率低（人工判读等） 时间毒性（放射性标记物） （二）循环测序 （cycle sequencing） 1．基本原理： 先利用PCR扩增靶序列片段，制备测序模板，然后再利用 PCR 直接测定序列； 采用了PCR热循环高效合成 DNA 的特性并结合双脱氧核苷酸终止法，使引物链终止的延伸产物数量在热循环过程中得到增加，因此称为循环测序。 （二）PCR循环测序 每个测序循环包括： ①PCR扩增制备的模板DNA变性成单链形式；②标记引物与其中的一条链上的互补序列退火； ③退火后的引物在耐热DNA聚合酶催化下发生链延伸终止反应。 上述循环步骤重复20~40次，使链终止 产物以线性方式获得扩增。 循环测序法 循环测序反应与普通PCR反应比较 循环测序的优点 简单、易操作； 所需模板DNA量少 PCR产物3～10ng； 减少模板的二级结构； 适合于双链及单链DNA测序； PCR产物可直接测序，效果好。 （三）荧光标记循环测序全自动分析 4种不同荧光染料标记ddNTP ； PCR循环扩增在同1管中； PCR仪上进行热循环反应； 单道凝胶电泳或毛细管电泳； 激光检测装置； 计算机自动分析结果。 1. 荧光标记循环测序步骤 1）模板制备：PCR扩增 2）反应体系：含适量的模板、引物、dNTP、荧光标记的ddNTP、DNA聚合酶、缓冲体系。 3）PCR热循环参数：94℃-1min；40～60℃-3