第3章基因工程的常规技术1.pptVIP

第一节 凝胶电泳技术 琼脂糖凝胶电泳基本原理 当用EB对DNA样品染色时，加入的EB就插入DNA分子中形成荧光结合物，荧光的强度与DNA含量成正比，如果用DNA片段的标准品作电泳对照，就可以估计出待测样品的分子量大小和浓度。 第二节 分子杂交技术 所依据的原理是，带有互补的特定核苷酸序列的单链DNA或RNA，当它们混合在一起时，其相应的同源区段将会退火形成双链的结构。  核酸杂交技术主要有Southern杂交、Northern杂交和菌落原位杂交等。 一、探针与探针标记 杂交的主要目的是为了检测出同源DNA序列，而为了达到这一目的，必需要有标记的探针。 带有能检测的标记物的DNA或RNA叫探针。 使DNA或RNA带有可检测的标记物的过程叫探针标记。 1.切口平移标记 用一定浓度的DNaseI在双链DNA的一条链的有限位置上打开切口。 利用DNA聚合酶I的5’ →3’的核酸外切酶活性将DNA一条链上的核苷酸一个一个的切除，同时暴露出另一条单链DNA。 以这条单链DNA为模板，利用DNA聚合酶I的5’ →3’的DNA聚合功能把一个一个带有标记的dNTP合成上去。 2.随机引物标记 能与任何DNA模板的多个位点配对互补的多个不均一序列寡聚核苷酸DNA片段叫随机引物。 DNA聚合酶Klenow大片段能在随机引物的引导下以带有标记的dNTP为原料合成新的与模板DNA互补的探针。 二、Southern杂交 根据毛细管作用的原理，使在电泳凝胶中分离的DNA片段转移并结合在适当的滤膜上，然后通过同标记的单链DNA或RNA探针的杂交作用检测这些被转移的DNA片段，这种实验方法叫做DNA印迹杂交技术。由于它是由E.Southern于1975年首先设计出来的，故又叫Southern DNA 印迹转移技术。 Southern DNA 印迹杂交之X光显像图片 水稻（Oryza sativa L.)的叶绿体DNA分别用核酸内切限制酶BglⅡ(A-C)、BamHⅠ（D-F）、EcoRⅠ（G-I）、和HindⅢ（J-L）消化，加样在含有EB染料的1%的琼脂糖凝胶电泳中作电泳分离，然后同32P标记的玉米psbA探针作Southern杂交。X光底片中显现的阳性条带 ，表明含有水稻的psbA基因序列。 三、Northern杂交 1979年，J.C.Alwine等人发展而来，是将RNA分子从电泳凝胶转移到硝酸纤维素滤膜或其他化学修饰的活性滤纸上，进行核酸杂交的一种实验方法。由于这种方法与Southern印迹杂交技术十分类似，所以叫做Northern印迹技术（Northern blotting）。 Southern杂交和Northern杂交的主要差别： 1.对象不同（DNA/RNA） 2.DNA在凝胶电泳分离后，用碱处理变性，形成单链。 RNA一般是进行变性电泳，在分离RNA的同时消除二级结构。 RNA变性电泳方法主要有甲醛变性电泳、羧甲基变性电泳和乙二醛变性电泳三种。 * 第八章 植物转基因技术(背景知识) 第一节 凝胶电泳技术 第二节 分子杂交技术 第三节 PCR技术 什么是电泳技术？ 电泳法，是指带电荷的供试品（蛋白质、核苷酸等）在惰性支持介质（如纸、醋酸纤维素、琼脂糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶等）中，于电场的作用下，向其对应的电极方向按各自的速度进行泳动，使组分分离成狭窄的区带，用适宜的检测方法记录其电泳区带图谱或计算其百分含量的方法。 特点： 1.可以制成非常均匀的凝胶，带电质点在凝胶的孔中泳动。 2. 电泳操作方法简便，电泳速度快 3. 分辨率高，重复性好，电泳图谱清晰。 琼脂糖 半乳糖及其衍生物构成的中性物质，不带电荷 本节主要介绍琼脂糖凝胶电泳技术。 琼脂糖与琼脂有区别么？ 琼脂糖链依分子内和分子间氢键及其它力的作用使其互相盘绕形成绳状琼脂糖束，构成大网孔型凝胶。 D-半乳糖 3，6-脱水-L-半乳糖 影响电泳迁移率的因素 DNA分子的大小 1 凝胶的浓度 2 DNA的构象 3 使用的电压 4 琼脂糖的种类 5 电泳缓冲液 6 嵌入染料的存在 7 影响电泳迁移率的因素 DNA分子的大小 1 凝胶的浓度 2 DNA的构象 3 使用的电压 4 琼脂糖的种类 5 电泳缓冲液 6 嵌入染料的存在 7 DNA分子大小迁移速率U与logN成反比（N为碱基对数目）。分子越大，摩擦阻力越大，同时大分子通过凝胶孔径的效率也低于较小的分子，所以分子大的迁移慢。 等量的空间结构，紧密的电泳快（超螺旋线性DNA） 一般来说，分子带的电