ELISA的原理教学文案.pptVIP

酶联免疫吸附试验（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA ）;ELISA的基本原理;免疫标记;免疫酶测定法(Enzyme Immuno Assay,EIA);酶联免疫吸附试验(Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay,ELISA);酶联免疫吸附试验(Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay,ELISA);酶联免疫吸附试验(Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay,ELISA);酶联免疫吸附试验(Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay,ELISA); ELISA的试剂;;标本的采取和保存;标本的采取和保存;标本的采取和保存;标本的采取和保存;试剂的准备 1.放冰箱内保存的试剂、在使用前应先恢复到室温。 2.仔细检查试剂各组分是否变质。 3.保存试剂的冰箱应定期检查其贮存温度（正常为2- 8℃），并尽量避免冰箱频繁开关。 4.试剂盒中本次试验不需用的部分应及时放回冰箱保存。 5. ELISA 中用的蒸馏水或去离子水，包括用于洗涤的，应为新鲜的和高质量的。 ;在ELISA中一般有3次加样步聚，即加标本，加酶结合物，加底物。 1． 严格按照说明书要求，按规定的量和顺序进行。 2．? 使用的微量加样器应注意保养并定期校正。 3．? 加样前应使溶液充分混匀，并将液体加在孔底，避免加在孔壁上部，注意不可出现气泡。加样前要看移液器的液面是否平齐。 4．? 加样时避免样本溅出，如有样本溅出孔外时，应用吸水纸轻轻拭干，并做相应记录。 5．? 加样后微孔板应及时温育，尽量缩短加样后温育前的等待时间。 6. 如果加样枪漏气以至于加样的量不够，不能用枪吸出再加，避免污染整条甩掉再重新加。 ;温育;洗涤;;显色 HRP的底物 DH2+ H2O2 E D+ 2H2O 上式中， DH2为供氢体， H2O2为受氢体。 DH2一般为无色化合物，经酶作用后成为有色的产物。 DH2如：邻苯二胺(OPD)、四甲基联苯胺(TMB)和ABTS 。 TMB经HRP作用后共产物显蓝色。TMB性质较稳定，可配成溶液试剂，只需与H2O2溶液混和即成应用液。酶反应终止后，TMB产物由蓝色呈黄色，可在比色计中定量，最适吸收波长为450nm，是HRP结合物最常用的底物。 。 HRP对氢受体的专一性很高，仅作用于H2O2、小分醇的过氧化物和尿素过氧化物(urea peroxide)。 ;显色是酶催化无色的底物生成有色产物的温育反应。反应的温???和时间仍是影响显色的因素。在一定时间内，阴性孔可保持无色，而阳性孔则随时间的延长而呈色加强。适当提高温度有助于加速显色进行。 TMB（四甲基联苯胺）受光照的影响。但为保证实验结果的稳定性，宜在规定的适当时间阅读结果。TMB经HRP作用后，约40分钟显色达顶峰，随即逐渐减弱，至2小时后即可完全消退至无色。 不使用过期显色剂，肉眼可见浅兰色的TMB显色剂不能使用。 显色剂避免在空气中暴露时间过长。 加显色剂尽量避免溅出孔外。37度避光显色。 ;比色;酶标比色仪;6 结果判断 ;4. ELISA的操作要点;ELISA的优点： 血清学方法有很多种, 如传统的琼脂扩散( A G ID ) 、 血凝抑制( H A / H I ) 、 乳胶凝集、 试管凝集、补体结合等方法，但这些方法不是最合适的检测方法。EILSA技术与其有着不同的特点： 1、灵敏度高。ELI SA是通过酶促反应放大检测信号, 从而提高检测的灵敏度, 其检测限可达 ng 甚至pg 水平, 可做定量测定。 2、特异性强。ELI SA的每一步体的特异性识别过程, 结构类似物、 有色物质、 荧光物质等对检测的影响很小。 3、样品的预处理过程和 ELI SA的操作步骤简单快捷，有的试剂盒仅需1~2个小时即可得出检测结果，并且可同时检测数十甚至上百个样品。 4、设备简单，适用于基层。;谢谢大家！