电镜超薄切片2.pptVIP

电子显微术 ２０世纪３０年代电子显微镜问世，６０年代电镜技术和生物样本制备技术获得进展。后发展了扫描电镜术、冷冻复型术、高压电镜术、Ｘ线显微分析术、扫描隧道显微术和原子力显微术等。 二、电镜的应用：正常结构；病理诊断；病原；化学；考古。 第一节、透射电子显微术 一、????????????? 透射电镜的原理 1 高速运动的并具有波动性和折射性的电子 2 电镜的各种像差 1）球差：是由于透镜不能把所有的入射光线聚集共同的焦点而产生的。 2）像散：这一缺陷主要是由于电子透镜实际上不可能做得完全对称。 3） 色差：可见光的波长不同。 4）畸变:在低倍镜时经常发生.因为图像中心部分和周边部分的放大倍数不同. 二、透射电子显微镜的结构 1 电子枪 2?????? 聚光镜系统 3?????? 样品室 4?????? 成象系统:物镜、 第一中间镜、 第二中间镜、投影镜。 5?????? 观察和记录系统 三、透射电镜的使用 1 加速电压的选择：40-100kV可以一档一档的调节。加速电压对电镜的性能有以下的影响：一般样品薄时40-60KV，一般样品60-80KV，厚时100KV。 1） 电压越高，电子穿透能力越强； 2）对于某些生物制品，电压越高，图象反差越小； 3）电压升高电子枪亮度增加，荧光屏亮度也增加； 4）电压升高对提高分辨率有利。 2 聚光镜光阑和物镜光阑的选择 聚光镜光阑：200-300um;物镜光阑：20-70um. 3 放大倍数的选择 选择放大倍数的两个原则：①感兴趣的区域充满整个照相底片；②感兴趣的细节特征十分容易测到。 4．选视野、调焦和拍照 （1）把要拍照的视野移至屏中心6×9黑框内。 （2）用OB FOCUS调焦，拍照前使OB置于稍欠焦位置上以增加反差。 （3）核对是否存有像散，核对光斑是否居中，核对灯丝是否饱和对称。 （4）根据事先已在计算机上设定好的最佳光强度，调节BRIGHTNESS，使PAG1上的 EXP TIME为设定值（参考第三章）。 （5）盖上观察窗，按下PHOTO，即自动曝光。 透射电子显微镜生物制品制备技术 冰冻蚀刻复型术 冰冻割断术Freeze etch replica Freeze cracking 电镜细胞化学术electron microscope cytochemistry 免疫组织化学技术 免疫电镜术 Immunohistochemistry Immunoelectronmicroscopy 电镜放射自显影术 显微放射自显影技术Electronmicroscope Autoradiography Microautoradiography 扫描电镜技术 Scanning electron microscopy SEM 现有的透射电镜生物制品制备技术分为两类： 一类是透射电镜的基本制备技术，包括超薄切片和负染色法； 另一类是生物制品的特殊技术，其中包括冷冻蚀刻法、冰冻割断术、电镜细胞化学术、免疫电镜术、电镜放射自显影技术、X线微区分析技术等。 1、????? 超薄切片样品的制备 （1）?? 取材( 基本要求是在活体情况下进行) 取材的原则(快、准、轻、小、冷的原则） 1）? 快速：1分钟之内投入固定液。 2）?? 块小：0.5-1mm3或截面1mm2的长条。 3）?? 部位准 4）? 损伤小：器械应锐利，避免牵拉、挤压，防止组织受机械损伤。 5）??? 低温：0-4oC 取材的方法 1）动物材料： 对神经组织等要进行原位固定或灌注固定，待组织适当硬化后再取材。 2）培养细胞(Cell culture)： 生长在瓶中的细胞到足够的量，先倒去培养液，然后倒入适量的戊二醛固定液，在冰浴下3-5分钟、弯头吸管吹打或用软器械轻轻地刮下贴壁的细胞，将这种混合液倒入离心管中，2000rpm低速离心15-20分钟，使细胞呈团，弃去上清液，换一次固定液，将其移入修块台，修快成标准块4oC固定、待用。 3）单细胞悬液：精子、血球等其他不易聚集的悬浮游离材料，可加入等量的戊二醛和其他类型的固定液，轻轻地把他们悬浮在固定液中。 经过固定处理后 再离心成团， 在50oC中弃去上清液， 加入适量的经50oC 预温的2%的琼浆， 使团悬浮，将悬浮团 和琼脂液一同在薄片 上展层，固定后 切成1mm3的小块。 （2）固定 (fixation) The aim is to avoid digestion by enzymes (autolysis) or bacteria and to preserve the physical s