国家自然基金项目-基于基因密码子扩展的蛋白质标记新方法.DocVIP

项目名称： 基于基因密码子扩展的蛋白质标记新方法 首席科学家： 起止年限： 2010年1月-2014年8月 依托部门： 教育部 一、研究内容 1、拟解决的关键科学问题 （1）利用酪氨酸、亮氨酸和吡咯赖氨酸氨酰tRNA合成酶/tRNA正交对，以及大肠杆菌和酵母筛选系统，在蛋白质中特定位点引入特殊的非天然氨基酸，包括荧光氨基酸、具有生物正交化学反应性能的非天然氨基酸、高效率的光交联氨基酸、较大双光子吸收截面的光转化氨基酸、磷酸化的氨基酸、含有19F （2）针对已有筛选系统效率不高的问题，发展结构生物学和计算生物学的方法，为筛选体系建立理论指导。 （3）发展和优化以“无铜点击化学”为代表的活体蛋白质特异正交标记技术。 （4）发展和优化氟取代化学反应，以期在蛋白质中引入19F （5）发展蛋白质特异标记方法，揭示哺乳动物细胞和线虫细胞的运动机理。 （6）拓展蛋白质特异标记方法，发现药物新靶标，优化蛋白质药物的靶向性和半寿期。 2、主要研究内容 本项目的主要研究内容是以在蛋白质特定位点插入非天然氨基酸为主要研究手段，结合超高分辨率荧光成像、核磁和顺磁共振技术和结构生物学、蛋白质组学技术，深入研究细胞生物学和医药学研究中所涉及的重要科学问题。 （1）基因编码非天然氨基酸筛选平台的构建 通过人工进化的方法增加编码非天然氨基酸。首先把无义密码子“UAG”确定为新的遗传密码，进而对天然的转运核糖核酸（tRNA）基因突变,使其含有反密码子“CUA”。在此基础上从氨酰-tRNA合成酶突变库中，筛选出可专一结合这种tRNA和指定非天然氨基酸的氨酰-tRNA合成酶突变体。然后再将生命体中mRNA上任意一个遗传密码取代为UAG,并在培养基中加入化学合成的非天然氨基酸，从而在蛋白质中的相应位置插入具有特殊物理或化学性质的非天然氨基酸。其简要技术路线见图1: 图1：基因编码的非天然氨基酸的总体技术路线及正负循环筛选途径 （2）真核细胞蛋白质翻译起始机制的解析 eIF2α磷酸化作为蛋白质翻译起始的“总开关”，受到多种细胞胁迫信号的控制，与GCN2,PKR,HRI,PERK等因子发生直接作用，发挥尚待确证的复杂的生物功能。我们将通过在eIF2α的特定位点引入磷酸化的氨基酸，解析eIF2α蛋白质与诸多细胞因子（如PKR）复合物的结构，并从分子机理，特别是磷酸化的角度阐明细胞响应胁迫信号的途径。我们也将对蛋白翻译起始过程中起重要作用的细胞因子做荧光和光交联标记，以求获得对蛋白起始复合物动态调控机制的全面理解。 （3）细胞运动的分子机理解析 细胞中许多重要的生理活动，如细胞移动、胞吞、细胞浆移动等，都受肌动蛋白(actin)聚合的调控。Spire是新的actin核化因子，具有非常重要的生理功能。为了研究它们在胞内actin结构中的精确定位，我们将具有光交联活性的氨基酸插入到Spire蛋白中对它进行标记，发现新的相互作用蛋白并研究它们的动态相互作用，以及对其它核化因子调控的影响。我们还将使用基因转导方法在线虫活体中引入正交氨酰tRNA合成酶和tRNA的稳定表达系统，使得在线虫活体中可以用TAG停止密码子编码非天然氨基酸。通过这个技术研究线虫精子运动的活化因子和活化因子的受体蛋白偶联的囊泡运输与胞吐。 （4）GPCR类细胞跨膜蛋白的受体激活和信号转导机理的研究 细胞膜上的受体蛋白如GPCR是一类极为重要的跨膜蛋白，在信号转导过程中发挥着关键作用，也是目前药物研发领域中最为关注的靶点之一。GPCR是一类典型的膜蛋白，其α螺旋链共七次跨膜，因而只有在活体细胞膜原位上进行研究才有意义。这其中，如何在活体细胞内观察GPCR的状态、结构变化、偶联程度等都是研究的热点，对GPCR工作原理的动态跟踪更是目前人们最为关心的问题。由于荧光蛋白的体积过大，对细胞跨膜蛋白的结构和性质所造成的干扰相当严重。我们希望通过基因编码的非天然氨基酸和生物正交反应对GPCR进行定点特异地小分子荧光标记，从而在对GPCR结构和性质不造成干扰的情况下，特异、高效地使用FRET及单分子荧光等手段对GPCR的受体激活、信号转导机理等关键性问题进行研究，在分子尺度上对GPCR的工作原理及信号转导过程中的结构变化进行精确的观察与捕捉，解决现有研究手段无法涉及的难题。 （5）抗病毒药物靶标的发现 非天然氨基酸可以选择性插入到活体蛋白的任何位置，如果在病毒包膜蛋白上插入了具有光交联活性的非天然氨基酸，在病毒感染细胞的动态过程中，一旦受光照激发，该非天然氨基酸将会与病毒结合的细胞受体或辅助受体共价结合，从而捕捉新的抗病毒药物靶点。由于光照交联是不可逆的，通过弱的蛋白-蛋白间的相互作用或者呈瞬间方式与病毒结合的蛋白，将会因此而富集起来，从而改善了蛋白免疫共沉淀方法的灵敏度和准确性。将具有特殊化学、物理甚至生理性质的非天然氨