植物原生质体培养细胞融合.pptVIP

第15章 植物原生质体培养 及细胞融合 植物原生质体培养和细胞融合是植物细胞工程的核心技术. 原生质体是指用特殊方法脱去植物细胞壁的、裸露的、有生活力的原生质团。 1960年英国植物生理学家Cocking首次利用纤维素酶等从番茄根细胞分离原生质体获得成功。1971年Takebe等培养烟草叶片原生质体获得再生植株，首次证实了原生质体的全能性。1972年美国科学家Carl—son等利用细胞融合技术，首次获得两种不同烟草原生质体融合的体细胞杂种。 1974年高国楠等开发出了PEG融合方法。1978年德国科学家Melchers等把马铃薯和番茄的原生质体进行融合，获得了体细胞杂种——马铃薯番茄。1981年Zinune~ann开发出了高压脉冲法，即电融合技术. 植物原生质体培养和细胞融合技术成为品种改良和创造育种亲本资源的重要途径。迄今已在多种作物上获得了原生质体植株和种、属间杂种植株，也为细胞生物学、植物生理尝及体细胞遗传学的研究做出了重要贡献。 (一)植物细胞膜电特性和膜电位 植物细胞膜是一个由脂类和蛋白质等构成的双层分子层膜，其物理性质类似于一个双电层，细胞的内外层带的是同种电荷。不同植物的细胞膜电位不同，同种植物细胞倍性不同以及在不同外界离子环境下，其细胞膜的膜电位也不同。 (二)植物细胞壁的结构及其化学组成 植物细胞壁可分为初生壁(primarywall)和次生壁(secondarywall)，相邻两个细胞的初生 壁之间存在中层(middlelayer，亦称胞间层)。初生壁的主要成分是纤维素、半纤维素和果胶，还有少量结构蛋白。纤维素是p—1，4连接的D—葡聚糖，含有不同数量的葡萄糖单位。纤维素化学性质高度稳定，能够耐受酸碱及其他许多溶剂，是一种比较亲水的晶质化合物。半纤维素是存在于纤维素分子之间的一类基质多糖，它的种类很多，如木葡聚糖和胼胝质等。 细胞壁上常有附属结构。植物的某些细胞在特定的生长发育阶段可形成特殊的细胞壁，如花粉壁是由孢粉素的覆盖层和基粒棒层构成花粉外壁外层和外壁内层工，由纤维素构成外壁内层Ⅱ及内壁。 植物细胞壁的复杂程度因植物器官种类、成熟度和生理状态而异。选择原生质体分离的外植体材料时，一般选择较幼嫩的组织，最好选用试管苗、愈伤组织或悬浮培养细胞，这类材料的原生质体产率高，活性强，培养后细胞植板率高。 (三)降解细胞壁的酶类及细胞壁降解机理 用于植物原生质体分离的酶类有纤维素酶、半纤维素酶和果胶酶。 纤维素酶的商品酶主要有CellulaseOnozukaRS、GellulaseOnozukaR—10、GA3—867。其绍分为CX(P—1，4—葡聚糖酶)、C1(含p—1，4—葡聚糖纤维二糖水解酶)和p—葡萄糖苷酶等o CX能使纤维素分子链分离，破坏微纤丝的晶态结构。C1和p—葡萄糖苷酶则催化纤维素分子链水解为葡萄糖。 这两类酶均为内切酶，可随机切断主链内的糖苷键而生成寡糖，常用浓度为0.1％～0.5％。 果胶酶主要的商品酶有MaceozymeR—10、PectolyaseY23、Pectinase。其组分为解聚酶(又称多聚半乳糖醛酸酶)和果胶酯酶(又称果胶甲酯酶)，二者均能催化果胶质水解。解聚酶能催化以α—1，4—键连接的半乳糖醛酸水解为D—半乳糖醛酸及其二聚物、三聚物等。果胶酯酶能催化果胶质的甲酯水解成甲醇及其二聚酸。果胶酶的一般酶制剂含有一些有害的水解酶类，如核糖核酸酶、蛋白酶、脂肪酶、过氧化物酶、磷脂酶、酚和盐等。使用前应进行离心，，并尽量缩短酶解处理时间。 上述商品酶中，PectolyaseY23活性最强，其活性是MaceozymeR-10的近100倍，但处理时间不宜过长，一般不应超过8h。上述酶的常用浓度，MaceozymeR—10为0.2％～2.0％，PectolyaseY23为0.5％一022％，Pectinase为0.2％～2.0％。Pectinase杂质较多，其酶液在过滤灭菌前必须离心去除沉淀，否则很难进行过滤灭菌。 (四)材料来源 1．材料来源 供体材料是影响原生质体培养成功与否的关键因素之一。 原则上讲，植物的茎、叶、胚、子叶、下胚轴等器官组织以及愈伤组织和悬浮培养细胞均可作为原生质体分离的材料，目前较多采用叶片来分离原生质体，但分裂旺盛的、再分化能力强的愈伤组织或悬浮细胞系，尤其是胚性愈伤组织或胚性悬浮细胞系是最理想的原生质体分离材料。 2．预处理 常采用两种预处理方法： ①低温处理。以叶片等外植体为试材时，一般放在412下，黑暗中处理1～2d，其原生质体的产量高，均匀一致，分裂频率高。 ②等渗溶液处理。把材料放在等渗溶液中数小时，再放到酶液中分离原生质体，能提高其产量和活性，尤其是多酚化合物含量高的植物，如苹果、梨等，采用这种处理方