Western Blot基本原理和技术概论 凝胶成像系统.ppt

●大多数聚丙烯酰氨凝胶是手工制备的, 胶灌在两块垂直板之间, 用样品梳留出加样的地方. 在缓冲液槽的正负极两端加载电场, 即可使蛋白质在介质中泳动.凝胶介质起到一种筛分的作用, 小分子泳动得比大分子快。 SDS 非共价地结合蛋白, 结合比例是1个SDS 结合2个氨基酸分子, (或者每克蛋白结合1.4克SDS) , 所以几乎遮盖了蛋白本身原有的电荷性. 使所有被包裹的蛋白分子具有相同的 “荷质比”, 它们的泳动速度主要与各自的质量大小相关,因而依此可以推算分子量。 不连续的2层含义:((1) pH不连续, (2) Glycine 在2层凝胶中的场强不同, (其等电点为6.07, 中性氨基酸, )前低后高,因而把蛋白压缩成一窄带. 一旦Glycine 跑到蛋白质前端后, 电场就是个均一的,蛋白会按照大小质量进行分离. Tris-Glycine缓冲液的pH=9.75, (Tricine-Glycine的pH=7.4, 250mM MES 的pH=6.15, 250mM MOP的pH=7.2, 使Cysteine半胱氨酸始终处在还原性环境中, S=S键不易被破坏,适合小分子蛋白分离和条带的锐化.) 电泳分离蛋白常采用不连续的缓冲液系统, 通常在分离胶段的顶部还有一段孔径较大的浓缩胶. 配置这两段凝胶时用不同的pH值的缓冲液。电泳开始阶段, 缓冲液离子和样品中的蛋白以同样的速度进入浓缩胶; 到两层胶界面处, 大小蛋白被压缩成一条很薄的区带。 进入分离胶后.分离胶密集细小的孔径对不同大小的蛋白起到筛分效果.不同的质量的蛋白开始逐渐拉开距离, 显示出不同的条带位置格局. (1)电压高, 产热大, 受热不均,向上︶ 通常200V, 112mA (2) Tris/Glycine 配比错误, 或酸,碱调节pH时引入过量的离子, 造成上槽buffer 离子浓度大,电流增大,产热大, ,向上︶ (3)电泳槽的装置不合适（垫圈密封性不好或者不正确的装配）引起的，其结果是导致上槽缓冲液从垫圈角落凹下处渗漏，缓冲液从凝胶的中间先消耗尽，导致电泳速度缓慢或者在中间区域停留。由于边缘的吸附效应，凝胶两侧的泳动受影响很小，最终导致指示剂前沿向下︵ ︵。 转印技术是指在凝胶中分离的蛋白质向印迹膜载体转移的过程. 它可以保持蛋白在凝胶中的高分辨率,而且可以准确,快速,高效. 由于凝胶中的蛋白往往不能直接与抗体蛋白结合, 我们需要将它们转移到膜上, 使之更容易接近抗体蛋白, (我们也称之为探针) Electrical current is conducted through the blotting buffer and negatively charged proteins migrate from gel onto membrane. 湿转：100v 90min 或者30v8h到过夜 * 电转印过程中, 蛋白在凝胶中的移动方向,取决与靶蛋白的分子大小,以及其等电点与缓冲液pH值的相对值. pH: 蛋白在它的等电点附近不能全部转印, 所以缓冲液的pH值应该比靶蛋白的等电点高或低2个pH. 不连续的缓冲体系,(阴极buffer加入少量0.1%SDS, 阳极buffer 加入少量甲醇),充分发挥各自的优点, 可以提高转印效率. CAPS buffer (PH 9.6) 3.高电场强度转印和标准电场强度转印. 恒流模式: V, P 随电阻降低而降, 适合标准转印, 即通过低功率输入,延长转印时间, 这种模式适合宽分子量范围的蛋白质分子完全转印, 保证高分子蛋白有足够的时间,又可保证小分子量蛋白在低电场强度下与膜有效结合; 恒压模式: 刚开始时, 电阻可能很大, 电流低, 随时间, 使电阻值降低, 电流增大. 可以形成稳定的电场, 达到最高转印效率; SDS的量与蛋白转印效率成正比, 但会造成蛋白与膜的结合力下降,影响蛋白与抗体的活性; 甲醇的量与蛋白转印效率成反比, 通常20% 为优化量. 但甲醇有助于蛋白同硝酸膜结合; 3. 转印膜孔径不合适 (稍大),举例 15kD蛋白与硝酸膜结合率较低, (也容易被洗掉), 需改用0.2uM的PVDF膜. 3. 转印膜孔径不合适 (稍大),举例 15kD蛋白与硝酸膜结合率较低, (也容易被洗掉), 需改用0.2uM的PVDF膜. 封闭：37度2h PBST洗膜3次 每次10min 一抗：4度过夜 PBST洗膜3次每次10Min 二抗：室温1h PBST洗3次 每次10min * 为什么要用二抗? 能否直接标记第一抗体? Membrane 对蛋白具有非常强的吸附力, 又容易处理, 经得住漂洗; 二抗能识别结合多个一抗上的抗原表位, 能将信号放大10-50倍. Note that many custom