流行性乙型脑炎灭活疫苗制造及检定规程.doc

流行性乙型脑炎灭活疫苗制造及检定规程 流行性乙型脑炎（下称乙脑）灭活疫苗是将乙脑病毒接种于地鼠肾细胞，培育后收获病毒液，加入甲醛溶液将病毒杀死后制成。用于预防乙脑。 1　毒种 1.1　毒种来源 P3株病毒，每3～5年应用新分离的乙脑流行株病毒检查P3株的保护力，以了解该毒株的有效性。P3株干燥毒种由中国药品生物制品检定所分发。 1.2　毒种检定 1.2.1　无菌试验 毒种启封和每次传代后均需做无菌试验，合格者方可使用。 1.2.2　病毒滴定 每正代必须用体重7～9g小白鼠进行脑内滴定，滴度≥9.0LogLD50/1.0ml可用于生产。 1.2.3　纯毒试验 生产前和生产末期用小白鼠做脑内法中和试验，以鉴定毒种的特异性。所用特异性抗血清由中国药品生物制品检定所提供。中和指数必须在500以上。生产过程中如对毒种发生疑问，应及时进行鉴定。 1.3毒种传代 分正亚代传递。从检定所取回的干燥毒种传递不超过15代称正代，由正代传递一代直接用于生产称亚代。每次用于传代的毒种不得少于3个鼠脑。 传代时选用体重7～9g健康小白鼠或乳鼠，脑内接种病毒，72小时后选眼结膜正常，有典型痉挛战粟、肢体麻痹的小白鼠，无菌取脑并进行无菌试验。 1.4　毒种保存 鼠脑毒种收剖经无菌试验后立即保存于-60℃以下，无菌试验通过后方可使用。亦可将鼠脑毒种研磨乳化制成10%脑悬液，分装小瓶冻存于-60℃以下，无菌试验合格后备用。 2　疫苗制造 2.1　细胞制备 2.1.1　地鼠 选用健康地鼠。如发现肾脏异常或有乳糜状腹水，应废弃。 2.1.2　细胞消化及培养 取肾剪碎，用适量的胰蛋白酶溶液消化。用营养液分散细胞，制备细胞悬液，分装培养瓶，于37℃进行培养。营养液中牛血清含量不得超过8%。 2.1.3　外源因子检查 每生产批细胞留5%（或不少于500ml）悬液作为对照细胞检查外源病毒。该细胞除不接种病毒外，细胞浓度和处理均与生产过程平行进行，至原液收获之日用显微镜观察，应无病变发生。并用0.2%～0.5%豚鼠红细胞（4℃保存不超过7天）进行血吸附试验，置4～8℃30分钟判定结果，再置20～25℃30分钟再次判定结果，均应为阴性。如有可疑病变或血吸附可疑阳性，在同种细胞上继续盲传，如传出病毒，该批细胞制备的疫苗应予废弃。 2.2　病毒接种和培育 挑选生长良好的细胞瓶，充分淋洗细胞后加入适量维持液，接种病毒，病毒量不得＞7.0LogLD50/1.0ml。在适当温度下培育适当时间，弃去病毒培养液，换以新维持液，继续培育一定时间。 疫苗生产过程中不得加青霉素或其他β内酰胺类抗生素。 2.3　原液 2.3.1　过滤 选择有典型细胞病变的培养瓶，经肉眼检查无菌者进行澄清过滤，细胞质量好时，可再加入新维持液，继续培育，再次收获病毒液。 2.3.2　病毒灭活 过滤后的原液，于取出无菌试验和病毒滴定样品后加入甲醛溶液，其最终浓度不得超过0.05%，置适当温度下一定时间灭活病毒。过滤后加入硫柳汞防腐剂，其最终浓度不得超过0.01%。 2.3.3　原液检定 2.3.3.1　无菌试验 按《生物制品无菌试验规程》进行。 2.3.3.2　病毒滴定 每个滴定批代表疫苗不得超过15万ml，将样品10倍系列稀释，取至少3个稀释度，每个稀释度用体重7～9g小白鼠4只，每只脑内接种0.03ml，逐日观察，3日内死亡者不计，观察14天，滴度≥7.0LogLD50/1.0ml判为合格，不合格者可重试一次。 2.4　半成品 2.4.1　半成品取样 无菌试验合格及病毒灭活到期的疫苗原液，取样做灭活试验、效力试验和无菌试验。每次解剖的地鼠制备的疫苗为一生产批，按生产批进行检定，但每批灭活试验代表疫苗量不得超过15万ml，每批效力试验代表疫苗量不得超过100万ml。无菌试验按《生物制品无菌试验规程》进行。 2.4.2　半成品检定 2.4.2.1　灭活试验 （1）动物法：将样品脑内接种体重12～14g小白鼠8只，每只　0.03ml，同时腹腔接种0.5ml，为第一代；7天后将第一代小白鼠处死3只，取脑做成10%悬液，脑内接种6只小白鼠，为第二代；7天后将第二代小白鼠处死3只，同法接种6只小白鼠，为第三代。从接种之日起逐日观察14天，每代小白鼠除处死和接种后3日内非特异性死亡者外，全部健存为合格。 若传代3日后有个别小白鼠死亡，应立即取死鼠脑乳化成悬液再接种3只小白鼠，观察14天，该3只小白鼠健存仍判为合格。如仍有小白鼠死亡，该批疫苗应重试，重试合格后仍可使用。若传出活病毒应重试，查明原因。必要时继续灭活并进行灭活试验，若仍传出活病毒，该批半成品应予废弃。 （2）细胞培养-动物法：将样品25ml透析24小时后，接种地鼠肾细胞或BHK21细胞，每ml样品接种不少于3cm2细胞片，置培养病毒的温度下培育14天，不得有细胞病变出