人二倍体细胞建株检定及制备疫苗规程.doc

人二倍体细胞建株检定及制备疫苗规程 人二倍体细胞株来源于正常人胎儿组织，主要用于培养病毒制备疫苗等。 [B]A细胞株的要求[/B] 用于疫苗生产的人二倍体细胞株（以下简称细胞株）须按下列规定进行全面检定。新建立细胞株，应按《新生物制品审批办法》进行审批。 1　建立细胞株必须具备下列资料 1.1　建立细胞株所用的胎儿的胎龄和性别，中止妊娠原因。 1.2　建立细胞株所用胎儿的父、母年龄、职业及健康状况，胎儿父、母系三代应无明显遗传缺陷和肿HYPERLINK \o 书籍相关：瘤 瘤疾病历史。在取胎儿组织时，应作出详细调查，报卫生部审批前，应进行一次重复调查。 1.3　原始组织种类，原代培养的数量与生长状况。 1.4　细胞培养史和生长特征，细胞寿命、世代数。 1.5　细胞生长液的成分。 2　细胞株的检定 2.1　染色体的鉴定和制片 细胞原系建株过程，每8～12世代*应作一次染色体检查，一株细胞整个生命期内连续培养过程中，至少应有4～5次染色体检查结果。 每次染色体检查，应从同一世代不同细胞培养瓶中取细胞混合再培养，制备染色体标本片。染色体标本应长期保存（直至褪色不能用为止），以备复查。 每次染色体检查，至少应随机取1000个分裂中期细胞，进行染色体数目、形态和结构检查，并作出有助于复查的记录，其中至少选择50个分裂中期细胞进行显微照相，作出核型分析。并应粗数500个分裂中期细胞，检查多倍体的发生率。 可以G分带或Q分带技术检查50个中期细胞染色体带型，应用照相图片作出带型分析。以显带技术检出的核型异常（假二倍体、倒位、易位等）发生率应用比现用上限更宽的基本数据进行评价，合格上限尚未定出。 2.1.1　合格要求 1000个和500个中医细胞标本中，检查异常率、合格的上限（可信限95%，Poison法）如表1。 表1 异常 检查细胞数（个） 1000 500 100 染色单体和染色体断裂 47 26 8 结构异常 17 10 2 超二培性 8 5 2 亚二倍性* 180 90 18 多倍性** 30 17 4 *亚二倍性超过上限时，可选用批标本片重数 **+一个中期细胞内超过53条染色体即为一个多倍体 2.1.2　染色体制片要求 应及时进行制片质量检查，如发现细胞堆积，染色体分散不好等，由于技术原因不适于读片时，可以及时重新制片。但已经读片后，不断因某项超过标准（亚二位性除外）而废弃不算。如考虑到制片技术与质量问题，可重试两次，当有一次结果与原结果相近时，又无可知原因，应以原结果为准。 2.2　外源因子检查 细胞株不应有细菌、霉菌、支原体和病毒等污染。每8～12世代细胞培养物，应进行下列检查。 2.2.1　细菌、霉菌、支原体检查 按《生物制品无菌试验规程》进行。 2.2.2　病毒检查 2.2.2.1　细胞直接观察及红细胞吸附试验 取混合瓶细胞样品，接种小瓶或小管，长成单层后更换维持液，观察2周，镜检细胞，应保持正常形态特征。培养7天，用0.2%～0.5%鸡和豚鼠混合红细胞悬液进行红细胞吸附试验，先置于4～8℃，后置于20～25℃，各30分钟，两次观察结果均应为阴性。 2.2.2.2　细胞培养检查 细胞培养的上清液混合样品，至少接种4种细胞（原代人肾或猴肾细胞、原代兔肾细胞、人源传代细胞和另一批人二倍体细胞）。接种的样品量应占维持液的20%以上，于培养5～7天和14天时，进行红细胞吸附试验（见2.2.2.1项）。培养7天的上清液在同种细胞培养上盲传一代，观察14天，应无细胞病变，红细胞吸附试验应为阴性（在该试验的细胞维持液中，允许加入少量该细胞培养用的牛血清，以利细胞维持和观察）。 2.2.2.3　动物试验检查 用乳鼠、成鼠、家兔、豚鼠和鸡胚各一组。每组动物或鸡胚接种受检细胞不应少于107。按表2所列要求进行试验和观察。如80%以上动物和鸡胚健存，此试验为通过。 2.2.2.4　其他检查 细胞株传代过程中，至少于2个不同世代水平进行包涵体、乙型肝炎表面抗原及电镜检查，结果均应为阴性。 2.3　肿HYPERLINK \o 书籍相关：瘤 瘤原体检查 每8～12世代做一次细胞株的异种移植试验，观察细胞株有无致肿HYPERLINK \o 书籍相关：瘤 瘤性质，每次实验使用6只乳鼠（3～5日龄）或体重8～10g小白鼠，经抗胸腺血清（ATS）处理，皮下接种活二倍体细胞（最适传代的细胞），观察14天，检查有无结节形成。有结节或可疑病灶时，做病理切片检查。试验同时，用HeLa或其他人源传代细胞系做阳性对照试验，用动物数与处理方法同试验组，接种被检二倍体细胞数应为对照肿HYPERLINK \o 书籍相关：瘤 瘤细胞数的5倍以上。结果二倍体细胞株不应有移植HYPERLINK \o 书籍相关：瘤 瘤形成，而对照组细胞则应有80%或更多的动物有