伤寒副伤寒甲乙三联菌苗制造及检定规程.doc

伤寒副伤寒甲乙三联菌苗制造及检定规程 本品系用伤寒、副伤寒甲、乙菌分别培育，取菌苔制成悬液经甲醛杀菌，以磷酸盐缓冲生理盐水稀释成每ml含伤寒菌1.5亿、副伤寒甲、乙菌各0.75亿制成。用于预防伤寒及副伤寒甲、乙。 1　菌种 1.1菌种来源 制造伤寒、副伤寒甲、乙三联菌苗用的菌种及检定菌种用的各种诊断血清，应由中国药品生物制品检定所分发或经同意。 1.2　菌种检定 检定菌种可用pH7.2～7.4的肉汤琼脂、马丁琼脂或其他适宜的培养基。 1.2.1　培养特性 各菌株应具有典型的形态、培养及生化特性。 1.2.2　血清凝集试验 用37℃培育18～20小时的培养物以磷酸盐缓冲生理盐水稀释成含菌6亿/ml，与相应的伤寒、副伤寒甲、乙菌诊断血清做定量凝集试验，摇匀后放37℃过夜，以肉眼可见到凝集（+）之血清最高稀释度为凝集反应之效价，凝集价不应低于血清原效价之半。伤寒菌种加用伤寒Vi及O血清做凝集试验，应与Vi血清有凝集，与O血清不凝集，或仅有较低凝集。 1.2.3　毒力试验 用37℃培育12～16小时的琼脂培养物以生理盐水稀释为下列浓度的菌液： 伤寒、副伤寒乙菌种：3亿/ml、1.5亿/ml及0.75/ml。 副伤寒甲菌种；15亿/ml、7.5亿/ml及3.75亿/ml。 根据菌种毒力情况稀释度可作更改，也可增加稀释度。 每一稀释度的菌悬液腹腔注射体重14～16g之小白鼠，至少5只，每只0.5ml，观察3天，使小白鼠于感染后3天内全部死亡的最小剂量为1个致死量（LD），伤寒、副伤寒乙菌种1LD应不超过1.5亿菌，副伤寒甲不超过7.5亿菌。 1.2.4　毒性试验 用37℃培育18～20小时之琼脂培养物混悬于磷酸盐缓冲生理盐水内，伤寒及副伤寒甲菌液加温56℃1小时，副伤寒乙菌液加温58℃1小时杀菌（或其他方法杀菌），不加防腐剂。杀菌试验合格后稀释为每ml含菌60、30及15亿等3个浓度，每一浓度的菌悬液以0.5ml腹腔注射体重15～18g小白鼠5只，观察3天，注射7.5亿菌之小白鼠应全部生存，注射15亿菌之5只小白鼠可有3只死亡。 1.2.5　免疫力试验 用加温杀菌（或用其他方法杀菌）不加防腐剂的菌液稀释成如下的浓度： 伤寒及副伤寒乙菌液：2.5亿/ml。 副伤寒甲菌液：5亿/ml。 每一菌液免疫体重14～16g小白鼠至少30只，每只皮下注射上述浓度的菌液0.5ml。注射2次，间隔7天，末次免疫后9～11天进行毒菌攻击。每种死菌菌液免疫之小白鼠各腹腔注射1LD的相应毒菌（含于0.5ml中），同时应用同批饲养或体重与免疫组相同的小白鼠3组，每组至少5只作对照，分别于腹腔注射2、1及1/2LD的毒菌（各含于0.5ml中），观察3天。对照组小白鼠感染2及1LD者应全部死亡，感染1/2LD者要有部分死亡。伤寒、副伤寒乙菌液免疫组至少保护70%小白鼠活存，副伤寒甲菌液免疫组至少保护60%小白鼠活存，则免疫力试验为合格。 免疫力试验也可用LD50法判定结果： 用加温杀菌（或用其他方法杀菌）不加防腐剂的菌液稀释成如下的浓度： 伤寒及副伤寒乙菌液：2.5亿/ml。 副伤寒甲菌液：5亿/ml。 每一菌液免疫体重14～16g之小白鼠至少30只，每只皮下注射上述浓度的菌液0.5ml，注射2次，间隔7天，末次免疫后9～11天，用培养12～16小时的伤寒、副伤寒甲或乙菌株之菌苔以pH7.2～7.4的肉汤及生理盐水等稀释至适当的浓度进行攻击。免疫组小白鼠应感染100个LD50以上的毒菌。同时应用同批饲养或体重与免疫组相同的小白鼠分为3～4组，每组至少5只，分别感染不同剂量毒菌作对照。免疫组及地照组分别腹腔注射0.5ml，观察3天，计算LD50。免疫组至少应保护70%小白鼠存活。 在做免疫力试验时，应以参考菌苗作对照。 1.2.6　抗原性试验 选体重2kg左右之健康家兔至少3只，用免疫力试验所用之菌液静脉注射3次每次0.5ml，第1次注射7亿菌，第2次14亿菌，第3次21亿菌，每次间隔7天。末次注射后10～14天采血做定量凝集试验测定效价。伤寒菌免疫的血清对免疫菌效价应不低于1∶12800，副伤寒甲、乙效价不低于1∶6400，2/3家兔血清之凝集价达上述要求即为合格。 1.3　菌种保存 菌种应冻干保存，冻干菌种保存于2～8℃。 菌种冻干后应抽取样品按1.2项进行检查，合格后可使用3年。以后每次生产前必须检查全部特性一次，合格者可继续使用2年。 2　菌苗制造 制造伤寒、副伤寒甲、乙三联菌苗所用的每一菌种选用2个菌株。 2.1　菌种 冻干菌种启开后应检查菌形、纯度及进行玻片凝集试验（伤寒菌加用Vi血清），合格后即可使用。每启开1支冻干菌种用于生产不应超过6代。 2.2　制造用培养基 用pH7.2～7.4的马丁琼脂或肉汤琼脂或其他适宜的培养基。 2.3　原液制造 2.3.1