第四章 原生质体融合课件.pptVIP

（三）单克隆抗体 1.何谓单克隆抗体？ 抗原：进入动物体内对肌体的免疫系统产生刺激作用的外源物质。 包括：蛋白质、多糖、核酸、病毒、细菌、各种细胞等。 抗体：动物免疫系统分泌的中和或消除抗原物质的影响的糖蛋白，存在于血清中，本质是免疫球蛋白 意义 理论上说，任何细胞都有可能通过体细胞杂交而成为新的生物资源，这对于种质资源的开发和利用具有深远的意义。 (四)植物杂种细胞筛选方式 1、遗传互补筛选法：利用每一亲本贡献一个功能正常等位基因，纠正另一亲本的缺陷，令杂种细胞表现正常。 如亲本1：叶绿体缺陷型 亲本2：光致死型 两亲本在光照下一种死亡，另一种呈白 色，融合细胞长成植株呈绿色，并能成长 2、抗性互补筛选法：利用亲本细胞原生质体对抗生素、除草剂及其它有毒物质抗性差异选择杂种细胞。 如： 亲本1：对放线菌素D抗性，但在MS培养基上不能超过50个世代 亲本2：对放线菌素D很敏感，但能在MS上生长 杂种细胞能在含有放线菌素的MS培养基上生长，而亲本和其它细胞死亡 3、利用物理特性筛选法：根据亲本的原生质体大小、颜色、漂浮密度及电泳迁移率、形成的愈伤组织的差异筛选杂种细胞。 亲本1：用异硫氰酸荧光素染色原生质体 亲本2：叶肉细胞原生质体 在荧光显微镜下，亲本1为红色，亲本2为绿色，杂种细胞可以区分 4、利用生长特性筛选法：利用原生质体对培养基成分要求与反应的差异选择杂种细胞。 例如粉兰烟草与朗氏烟草细胞原生质体均需外源激素才能生长，但其融合细胞可以产生内源激素，在培养基上不需加激素。 1978年德国科学家梅歇尔斯等人把马铃薯(potato)和番茄(tomato)的原生质体融合获得了体细胞杂种“泡马豆”（pomato) 酶解制备原生质体 原理 纤维素酶.半纤维素酶消化细胞壁的主要成分——纤维素，果胶酶消化使细胞连接在一齐的细胞间质，从而原生质体游离成球状的单细胞。 酶消化前，细胞先培养在较高渗透压的环境下，细胞适度质壁分离 ，这样细胞壁更容易被消化。细胞壁或细胞碎片通过过滤或离心而被分离。 （二)植物原生质体的制备 材料的来源 无菌试管苗 温室或生长室栽种的植物 培养细胞 方法： 1.撕去叶片的下表皮，然后以无表皮的一面向下，使叶片漂浮在酶溶液中； 2.把叶片或组织切成小块，投入到酶溶液中，可与真空渗入相结合。 2.植物原生质体的纯化 酶解后的混合物包括：解离酶液中，有原生质体，有破碎细胞的细胞器等，也有未解离的组织或细胞。而培养只要干净的原生质体，所以要进行纯化。 纯化的方法： A、清除较大碎屑：酶解后的混合物穿过一个镍丝网（50-70um） B、清除较小的物质：1.沉降法 2.漂浮法 3.界面法  13%甘露醇溶液 25%蔗糖溶液 Purified protoplasts 3.原生质体活力测定目测法：在显微镜下观察，根据细胞形态、流动性确定原生质体活力。?如形态上完整，含有饱满的细胞质，颜色新鲜的原生质体即为存活的。 FDA法：醋酸酯荧光素 伊凡蓝法：伊凡蓝不能穿过质膜，只有质膜受到严重损坏使，细胞才能被染色，因而可以通过细胞被染色与否确定活性。 Regeneration of fertile shoots from A. thaliana cotyledon protoplasts. Cotyledons prepared for digestion in a 3 cm diameter petri dish (a). Protoplast divisions after 4 days of culture (b) with subsequent microcolony formation (arrowheads) after 3 additional days (c) within the identical area of an alginate gel. Protoplast-derived colonies after two weeks of culture (d). Shoot formation from a protoplast-derived colony 19 days after protoplast isolation (e). Shoot regeneration (arrowheads) from protoplast-derived colonies after 5 weeks (f). Regenerates formed roots after 7 weeks (g) and seeds after 9 weeks (h) (三)植物原生质体的融合 （一）诱导融合的方法